تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية الحمض النووي الريبي من العينات الجراحية للشبكية البشرية لتحليل النسخ في انفصال الشبكية. باستخدام مجلة للقيام بذلك ، يتم تحضير الكواشف والمواد اللازمة لجمع العينة الجراحية في المختبر وإرسالها إلى المستشفى. أثناء العملية الجراحية ، يتم جمع العينة وإعادتها إلى المختبر.

ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام إجراء تدرج كلوريد السيزيوم الموحد ويتم تقييم جودة الحمض النووي الريبي المنقى. في النهاية. يظهر تحليل تعبير mRNA أن كلا من الالتهاب وتنكس المستقبلات الضوئية متورطان في انفصال الشبكية المشار إليه من خلال التغيرات في التعبير عن الجينات الرئيسية. في هذه العمليات التي تم تحديدها بواسطة التحليل النسخي ، فإن الميزة الرئيسية للمجلة على تنقية أورنا الموجودة مثل كلور GTIN من الاستخراج ، والمعروف أيضا باسم أولي ، هي نتيجة عدم تلوث الشفرية بالحمض النووي.

يمتد تطبيق هذه التقنية إلى علاجات انفصال الشبكية لأنها توفر وسائل تقنية لتطوير علاجات مساعدة جديدة. لكل عينة يتم جمعها ، استخدم ماصة خالية من الحمض النووي الريبي لملء أنبوب دائري دائري من البولي إيثيلين معقم سعة خمسة ملليلتر ب 2.4 مل من محلول كلوريد غين خال من ستة مليات من الحمض النووي الريبي. استخدم غاز الأرجون لملء الجزء العلوي من الأنابيب.

ثم ضع الغطاء بسرعة مع الضغط بإحكام للتأكد من إغلاقه. سيمنع ذلك أكسدة كلوريد غينيا على مدى عدة سنوات من التخزين في الخزانة الجراحية. بعد ذلك ، ضع كل أنبوب من الأنابيب المليلتر الخمسة في أنبوب سفلي مخروطي معقم سعة 50 مل.

بعد إضافة منديل ورقي وشد الغطاء ، ضع الأنابيب سعة 50 مليلتر في رف البوليسترين. ثم ضع الرف والمغلفات المعدة مع نماذج الشحن المعدة في صندوق من الورق المقوى في المستشفى. أحضر صندوق الورق المقوى من الخزانة الجراحية إلى غرفة الجراحة.

أثناء الجراحة ، ضع عينة الشبكية في أنبوب مملوء بالكمية ومحلول الكلوريد. أغلق الأنبوب بإحكام. امزج الأنبوب لفترة وجيزة.

ثم ضع الأنبوب على هزاز أنبوب الدم لمدة 10 دقائق. املأ نموذج العينة المرفق بتاريخ جراحة تحديد هوية المريض وأي ملاحظات إضافية. ثم اكتب رقم التعريف على أنبوب 50 مليلتر المرقم المقابل.

ثم ضع الأنبوب المكون من خمسة ملليلتر مع العينة الجراحية في أنبوب سعة 50 ملليلترا. استبدل المناديل الورقية وقم بتغطية الأنبوب. ثم ضع الأنبوب سعة 50 مليلتر ونموذج تناول العينة في المغلف المبطن المناسب وأغلقه.

بمجرد استلام العينة في المختبر ، قم بتجانس العينة في أنبوبها الذي يبلغ وزنه خمسة ملليلتر باستخدام الخالط بولي ترون TM بأقصى إعداد لمدة دقيقة واحدة أثناء تحريك الأنبوب لأعلى ولأسفل. بمجرد تجانس العينة ، لاستخراج السكريات ، أضف 270 ميكرولترا من أسيتات البوتاسيوم المولية وضع الأنبوب على شاكر في الوضع الأفقي. رج العبوة بقوة لمدة 10 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6،500 جم عند 20 درجة مئوية.

بعد الدوران ، استخدم ماصة لشفط الجزء القابل للذوبان بعناية دون إزعاج الحبيبات. انقل المادة الطافية إلى أنبوب خال من الحمض النووي الريبي المعقم سعة 14 مل. بجانب المادة الطافية ، أضف 5.3 مل من 1٪ و Laurel Sarcosine في 100 ، مليمولار ثلاثي ، و 3.2 جرام من كلوريد السيزيوم.

سيعمل الساركوزين على إذابة الغشاء ويستخدم كلوريد السيزيوم لتوليد تدرج. امزج الأنبوب عن طريق الدوامة لمدة دقيقة واحدة. أضف 1.8 مل من كلوريد السيزيوم EDTA إلى أنبوب طرد مركزي بوليمر معقم سعة 11 مل.

ثم باستخدام ماصة القس المعقمة سعة 10 ملليلتر ، ضع طبقة من محلول الحمض النووي الريبي على محلول EDTA من كلوريد السيزيوم عن طريق السماح له بالجري على السطح الداخلي للأنبوب. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي. استخدم أنبوبا ثانيا يحتوي على المخازن المؤقتة بدون شبكية العين كتوازن إذا لزم الأمر ، وقم بالدوران لمدة 24 ساعة عند 225،000 جم عند 20 درجة مئوية.

في اليوم التالي. بعد الدوران ، ستتشكل طبقة دهنية في الجزء العلوي من الأنبوب. سيكون الحمض النووي في المنتصف وسيتم تكوير الحمض النووي الريبي في الجزء السفلي من الأنبوب.

استخدم ماصة معقمة لإزالة الطبقة الدهنية العليا والتخلص منها بعناية باستخدام ماصة معقمة ثانية. قم بإزالة المحلول تدريجيا حتى يتم شفط الحمض النووي اللزج. تجاهل المحلول والحمض النووي.

ثم باستخدام ماصة القس المعقمة الثالثة ، قم بإزالة المحلول المتبقي والتخلص منه. الحرص على عدم إزعاج حبيبات الحمض النووي الريبي. الآن باستخدام مشرط معقم باللهب ، قم بقص الأنبوب كما هو موضح هنا وتخلص من الجزء العلوي.

ضع الجزء المتبقي رأسا على عقب على شاش معقم. اقلب الأنبوب واستخدم ماصة لشطفه بدقة باستخدام 160 ميكرولتر من كلوريد الغين. دع الحبيبات تجف لمدة 10 دقائق.

بمجرد أن تجف الحبيبات ، يتم تعليقها في 150 ميكرولتر من تريس ، E-D-T-A-S-D-S. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من tris و EDTA و 30 ميكرولترا من أسيتات الصوديوم الثلاثة مولية ، ثم الدوامة لترسيب الحمض النووي الريبي. أضف 900 ميكرولتر من المثلج البارد ، 100٪ الإيثانول.

بتدوير الأنبوب وضعه على الجليد الذائب لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 دقيقة عند 18،000 جم عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، قد تكون حبيبات بيضاء صغيرة مرئية وقد لا تكون مرئية.

سواء كان من الممكن رؤية الحبيبات أم لا ، استنشق المادة الطافية بدقة وتخلص منها. ثم لإزالة الملح الزائد ، أضف 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة ، و 70٪ من الإيثانول والدوامة ، وجهاز الطرد المركزي الأنبوبي ، والأنبوب لمدة 20 دقيقة عند 18 ، 000 جم عند أربع درجات مئوية. بعد تكرار غسل الإيثانول وتدويره بنسبة 70٪ ، استخدم ماصة P 200 لإزالة أي إيثانول متبقي.

دع الحبيبات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من الماء المعالج بقوة عن طريق الدوامة لمدة دقيقتين. ثم ضع العينة في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي بالكامل. أخيرا ، حدد تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر وقم بتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وفقا للبروتوكول. في الوثيقة المصاحبة ، لفحص نسخ انفصال الشبكية ، تم استخدام إجراء المجلة لاستعادة وتحليل الحمض النووي الريبي للشبكية من 18 مريضا يعانون من انفصال الشبكية و 18 ضابطا متطابقا مع العمر تم إعدادهم باستخدام شبكية العين بعد الوفاة.

تم تنقية الحمض النووي الريبي لاحقا وتحليله باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام وقاعدة الريتينو كما هو موضح في هذا التقرير الموضح هنا عبارة عن رسوم بيانية رادارية تمثل تعبير الخلايا الأحادية الكيميائية M CP جين واحد CCL اثنين. يتوافق الجزء الأيمن من الشكل المسمى RD مع الحمض النووي الريبي من مرضى انفصال الشبكية ، في حين أن الجزء الأيسر المسمى N هو الحمض النووي الريبي من الضوابط كما يتضح هنا. ينتج عن انفصال الشبكية تنظيم CCL الثاني كما يتضح من قيم C العالية في معظم عينات RD على اليمين مقارنة بتلك الموجودة في الضوابط على اليسار.

تشير هذه الزيادة إلى التهاب لدى المرضى الذين يعانون من انفصال الشبكية كما يتضح هنا. تم تقليل التعبير عن جين مستقبلات ضوئية القضيب GNAT واحد على النقيض من CCL الثاني ، والقيم منخفضة لعينات RD على اليمين ، وانخفاض في التعبير عن مخروط الموجة القصيرة opsin O PN واحد SW ، ولوحظ أيضا أن الجين المتماثل CRX يشير إلى تنكس المستقبلات الضوئية لكل من القضبان والأقماع في المرضى الذين يعانون من انفصال الشبكية من خلال هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتغيرات التعبير الجيني بعد انفصال الشبكية. يمكن تطبيقه أيضا على أمراض الشبكية الأخرى في النماذج الحيوانية مثل تنكس الشبكية الوراثي.

قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب معرفة بالحمض النووي. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية كحل ، والذي يكون الحمض النووي الريبي بعد الشهادة صعبا.