تنسيل الخلايا
تعد عملية تمرير الخلايا، أو الاستزراع الفرعي، إجراءً شائعاً يتم فيه تقسيم الخلايا من مزرعة معينة، أو "فصلها"، إلى مزارع جديدة وتغذيتها بأوساط نمو طازجة لتسهيل المزيد من التوسع. وبينما يبدو المفهوم في حد ذاته بسيطاً نسبياً، سنناقش في هذا الفيديو بعض الخطوات الأكثر أهمية للحفاظ الناجح على الخطوط الخلوية وتوسيعها.
تتراكم النواتج الأيضية السامة في أوساط زراعة الخلايا بمرور الوقت. وعند زيادة عدد الخلايا، يكون من المهم بشكل خاص تغيير الوسط الزراعي بانتظام للحفاظ على صحة الخلايا ومراقبة تمددها لتجنب النمو المفرط للخلايا.
بشكل عام، يتم إجراء الزراعة الفرعية لنوعين رئيسيين من الخلايا: الخطوط الخلوية الخالدة وخطوط الخلايا الجذعية
الخطوط الخلوية الخالدة هي خلايا مشتقة من كائنات متعددة الخلايا تعرضت لنوع من الطفرات التي تؤثر على تنظيم دورتها الخلوية، مما يسمح لها بالتكاثر إلى ما لا نهاية. ولعل أشهر الخطوط الخلوية الخالدة هو خط خلايا HeLa، الذي اشتق من آفة سرطان عنق الرحم وجدت في خزعة أُخذت من السيدة هنريتا لاكس في عام 1951.
وعلى عكس الخطوط الخلوية التي تكتسب الخلود بسبب السرطان، يتم توليد خطوط الخلايا الجذعية عن طريق عزل خلايا ذاتية التجدد ومتعددة القدرات من مجموعة متنوعة من الأنسجة، سواء كانت أنسجة بالغة أو جنينية. وتحت الظروف المناسبة، يمكن الحفاظ على هذه الخلايا في المزرعة إلى ما لا نهاية، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي ترونها هنا.
تُزرع الخلايا بشكل مثالي إما في حالة تعليق، مثل الخلايا الخالدة المعزولة من الدم، أو تنمو بشكل أفضل عندما تلتصق بسطح ما، كما هو الحال في العديد من الخلايا المشتقة من الأنسجة.
يجب مراقبة نمو هذه الخلايا الملتصقة بدقة لضمان صحتها. واعتماداً على نوع الخلية، تحتاج معظم الخلايا الملتصقة إلى إجراء عملية النقل (passage) عندما تصل نسبة تلاقيها (confluence) إلى 70-90%، أي عندما تغطي 70-90% من سطح وعاء الزراعة.
ضع في اعتبارك أن الخطوط الخلوية تحتفظ بالعديد من خصائص المزرعة الخلوية الأصلية، ولكن مع كل عملية نقل متتالية، قد تبدأ أيضاً في اكتساب خصائص فريدة بالمزرعة المتمددة. لذا، يرجى النظر في تحديد عدد مرات الاستمرار في نقل المزرعة الخلوية الواحدة.
عند تمرير الخلايا، من المهم استخدام تقنية معقمة والكواشف والمعدات المناسبة.
من الضروري استخدام الأوساط المناسبة لتحقيق النمو والتوسع الأمثل لسلالة الخلايا الخاصة بك. ستتطلب كل سلالة خلوية مزيجاً محدداً من مكملات النمو، ومع ذلك، تتطلب معظم السلالات الخلوية كحد أدنى المكملات التالية: المصل، مثل مصل الجنين البقري، والذي يجب معالجته حرارياً لتعطيل المتمم البقري والذي يوفر عوامل نمو حيوية للخلايا، والمضادات الحيوية، مثل البنسلين والستريبتومايسين، التي تساعد في الحد من نمو الملوثات في المزرعة، وعوامل نمو أخرى، مثل عامل نمو الخلايا الليفية، للمساعدة في إطالة نمو وتوسع السلالات الخلوية. احفظ أوساط زراعة الخلايا المكملة، أو "الكاملة"، عند 4 C عندما لا تكون قيد الاستخدام.
أولاً، لاحظ لون أوساط زراعة الأنسجة. تكون أوساط زراعة الخلايا الطازجة غنية بالمغذيات وتظهر بلون برتقالي صافٍ، ويرجع ذلك جزئياً إلى إضافة مؤشر pH، وهو الفينول الأحمر.
عندما تبدأ الخلايا في استهلاك المغذيات الموجودة في الوسط، تبدأ الفضلات والأحماض في التراكم في المزرعة الخلوية، مما يؤدي إلى خفض pH. لهذا السبب، تحتوي العديد من أوساط زراعة الأنسجة على الفينول الأحمر، الذي يحول لون الوسط من البرتقالي إلى الأصفر عندما تجعل الخلايا المزرعة حمضية. قم بتغيير الوسط قبل أن يتحول إلى هذا اللون!
عندما يحول الفينول الأحمر لون الوسط إلى اللون الوردي، مما يشير إلى أن pH قد أصبح قاعدياً جداً لنمو الخلايا الصحي، فقد يكون الوقت قد حان لتغيير أسطوانة CO2 بالإضافة إلى تغيير الوسط.
تلتصق معظم السلالات الخلوية الملتصقة بشكل طبيعي بالبلاستيك غير المطلي. لذلك، تُستخدم أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية، مثل أطباق بتري أو الأطباق ذات الـ 6 آبار، بشكل متكرر لاستزراع الخلايا الفرعي.
تُستخدم أيضاً دوارق زراعة الخلايا البلاستيكية. على سبيل المثال، يُستخدم دورق زراعة الخلايا T25 غالباً لتوسيع مجموعات السلالات الخلوية الصغيرة أو لبدء نمو سلالة خلوية تتوسع ببطء. أما دوارق الزراعة T75 فتُستخدم عادةً للسلالات الخلوية التي تتكاثر بسرعة أكبر أو لإنتاج أعداد أكبر من الخلايا مما يمكن أن يتسع له دورق T25.
عند إزالة الخلايا الملتصقة، يجب أولاً شطر البروتينات التي تربط الخلايا بالبلاستيك. لهذا الغرض، يُستخدم إنزيم التريپسين الهاضم بشكل متكرر. ومن المهم توقيت التعرض للتريپسين بدقة، حيث أن المعالجة لفترة طويلة جداً يمكن أن تؤدي إلى تلف بروتينات سطح الخلية الأخرى.
يمكن أن تحتوي أوساط زراعة الخلايا على معادِلات للتريپسين. لذلك، غالباً ما يُستخدم المحلول الملحي المنظم بالفوسفات، أو PBS، لغسل الخلايا قبل عملية التريپسنة.
يُستخدم EDTA، وهو مخلب للكالسيوم، أحياناً أيضاً لتعزيز الوظيفة المحللة للبروتين للتريپسين.
من أجل توسيع المستعمرة الخلوية، يتم بعد ذلك تنمية الخلايا الممررة حديثاً في حاضنة زراعة الخلايا تحت الظروف المناسبة لتلك السلالة الخلوية، وعادة ما تكون عند حوالي 37 C، و5% CO2، ورطوبة 95%.
قبل البدء، من المهم معرفة عدد مرات مراقبة الخلايا، وهو أمر يعتمد على سرعة تكاثر هذه الخلايا.
الآن، وبعد أن أصبح لون الوسط الغذائي برتقاليًا، افحص ظروف الزرع الأخرى، مثل ما إذا كان المزرعة عكرة - وهو ما قد يشير إلى حدوث تلوث - بالإضافة إلى حجم وكثافة مستعمرات الخلايا والجودة العامة للخلايا.
إذا وصلت الخلايا إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 90%، قم بإزالة وسط زراعة الأنسجة واغسل الخلايا باستخدام PBS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم.
أضف الآن التربسين إلى الخلايا ثم قم بحضنها عند 37 C. وبعد حوالي 5 دقائق، تأكد من انفصال الخلايا، ثم أوقف عملية التحلل البروتيني بإضافة وسط زراعة أنسجة جديد.
انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي لإجراء عملية الطرد المركزي. بعد ترسيب الخلايا، قم بإزالة السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط غذائي جديد. قم بعدد الخلايا التي جمعتها، ثم ازرع الخلايا وفقًا للكثافة المناسبة للتوسيع الفوري أو اللاحق.
بعد أن تعرفت على كيفية تمرير الخلايا، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة.
كما ذكرنا سابقاً، تعد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية نوعاً من الخلايا التي يجب تمريرها. وعادة ما يتم استزراعها بشكل مشترك مع أرومات ليفية جنينية للفئران، أو MEFs، والتي توفر عوامل تساعد الخلايا الجذعية على الاحتفاظ بحالتها متعددة القدرات.
يجب "التقاط" مستعمرات الخلايا الجذعية المزروعة على خلايا مغذية بمجرد وصولها إلى مرحلة النمو المناسبة. ويمكن اختيارها باستخدام الماصة الدقيقة أو عن طريق الكشط اللطيف باستخدام أداة التقاط زجاجية، ثم زرعها في مزرعة جديدة للتوسيع.
تكون بعض الخطوط الخلوية حساسة للهضم الإنزيمي أو تكون ملتصقة بشدة لدرجة أنه لا يمكن إعادة تعليقها بمعالجة التريبسين وحدها. يمكن استخدام كاشطة الخلايا لإزالة الخلايا بلطف من قاع طبق المزرعة. وإذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل خاص، فحاول تحريك ماصة سيرولوجية بحركة كشط قوية مع شطف قاع وعاء الخلايا بالوسط أو بمحلول مناسب آخر. توخ الحذر عند استخدام هذه الطريقة، حيث يمكن أن تتضرر الخلايا الرقيقة بسبب طريقة الفصل الميكانيكية هذه.
من أجل زيادة توسيع خلاياك بشكل أسرع وأكثر قابلية للتكرار مما يمكن تحقيقه في الدوارق أحادية الطبقة، يمكن استخدام الدوارق متعددة الطبقات، والتي يمكنها توسيع المزارع الخلوية بمقدار 3-5 أضعاف مقارنة بالدوارق أحادية الطبقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول تمرير الخلايا. استعرضنا في هذا الفيديو ماهية الخط الخلوي، وكيفية استزراعه فرعياً، وبعض التطبيقات المختلفة لتمرير الخلايا. شكراً للمشاهدة، وتذكر أن تحافظ على تجديد الوسط الغذائي!
تُستخدم الخطوط الخلوية بشكل متكرر في التجارب الطبية الحيوية، لأنها تسمح بالزراعة والتوسع السريع لأنواع الخلايا من أجل التحليل التجريبي. تُزرع الخطوط ا…
تعد عملية تمرير الخلايا، أو الاستزراع الفرعي، إجراءً شائعاً يتم فيه تقسيم الخلايا من مزرعة معينة، أو "فصلها"، إلى مزارع جديدة وتغذيتها بأوساط نمو طازجة لتسهيل المزيد من التوسع. وبينما يبدو المفهوم في حد ذاته بسيطاً نسبياً، سنناقش في هذا الفيديو بعض الخطوات الأكثر أهمية للحفاظ الناجح على الخطوط الخلوية وتوسيعها.
تتراكم النواتج الأيضية السامة في أوساط زراعة الخلايا بمرور الوقت. وعند زيادة عدد الخلايا، يكون من المهم بشكل خاص تغيير الوسط الزراعي بانتظام للحفاظ على صحة الخلايا ومراقبة تمددها لتجنب النمو المفرط للخلايا.
بشكل عام، يتم إجراء الزراعة الفرعية لنوعين رئيسيين من الخلايا: الخطوط الخلوية الخالدة وخطوط الخلايا الجذعية
الخطوط الخلوية الخالدة هي خلايا مشتقة من كائنات متعددة الخلايا تعرضت لنوع من الطفرات التي تؤثر على تنظيم دورتها الخلوية، مما يسمح لها بالتكاثر إلى ما لا نهاية. ولعل أشهر الخطوط الخلوية الخالدة هو خط خلايا HeLa، الذي اشتق من آفة سرطان عنق الرحم وجدت في خزعة أُخذت من السيدة هنريتا لاكس في عام 1951.
وعلى عكس الخطوط الخلوية التي تكتسب الخلود بسبب السرطان، يتم توليد خطوط الخلايا الجذعية عن طريق عزل خلايا ذاتية التجدد ومتعددة القدرات من مجموعة متنوعة من الأنسجة، سواء كانت أنسجة بالغة أو جنينية. وتحت الظروف المناسبة، يمكن الحفاظ على هذه الخلايا في المزرعة إلى ما لا نهاية، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي ترونها هنا.
تُزرع الخلايا بشكل مثالي إما في حالة تعليق، مثل الخلايا الخالدة المعزولة من الدم، أو تنمو بشكل أفضل عندما تلتصق بسطح ما، كما هو الحال في العديد من الخلايا المشتقة من الأنسجة.
يجب مراقبة نمو هذه الخلايا الملتصقة بدقة لضمان صحتها. واعتماداً على نوع الخلية، تحتاج معظم الخلايا الملتصقة إلى إجراء عملية النقل (passage) عندما تصل نسبة تلاقيها (confluence) إلى 70-90%، أي عندما تغطي 70-90% من سطح وعاء الزراعة.
ضع في اعتبارك أن الخطوط الخلوية تحتفظ بالعديد من خصائص المزرعة الخلوية الأصلية، ولكن مع كل عملية نقل متتالية، قد تبدأ أيضاً في اكتساب خصائص فريدة بالمزرعة المتمددة. لذا، يرجى النظر في تحديد عدد مرات الاستمرار في نقل المزرعة الخلوية الواحدة.
عند تمرير الخلايا، من المهم استخدام تقنية معقمة والكواشف والمعدات المناسبة.
من الضروري استخدام الأوساط المناسبة لتحقيق النمو والتوسع الأمثل لسلالة الخلايا الخاصة بك. ستتطلب كل سلالة خلوية مزيجاً محدداً من مكملات النمو، ومع ذلك، تتطلب معظم السلالات الخلوية كحد أدنى المكملات التالية: المصل، مثل مصل الجنين البقري، والذي يجب معالجته حرارياً لتعطيل المتمم البقري والذي يوفر عوامل نمو حيوية للخلايا، والمضادات الحيوية، مثل البنسلين والستريبتومايسين، التي تساعد في الحد من نمو الملوثات في المزرعة، وعوامل نمو أخرى، مثل عامل نمو الخلايا الليفية، للمساعدة في إطالة نمو وتوسع السلالات الخلوية. احفظ أوساط زراعة الخلايا المكملة، أو "الكاملة"، عند 4 C عندما لا تكون قيد الاستخدام.
أولاً، لاحظ لون أوساط زراعة الأنسجة. تكون أوساط زراعة الخلايا الطازجة غنية بالمغذيات وتظهر بلون برتقالي صافٍ، ويرجع ذلك جزئياً إلى إضافة مؤشر pH، وهو الفينول الأحمر.
عندما تبدأ الخلايا في استهلاك المغذيات الموجودة في الوسط، تبدأ الفضلات والأحماض في التراكم في المزرعة الخلوية، مما يؤدي إلى خفض pH. لهذا السبب، تحتوي العديد من أوساط زراعة الأنسجة على الفينول الأحمر، الذي يحول لون الوسط من البرتقالي إلى الأصفر عندما تجعل الخلايا المزرعة حمضية. قم بتغيير الوسط قبل أن يتحول إلى هذا اللون!
عندما يحول الفينول الأحمر لون الوسط إلى اللون الوردي، مما يشير إلى أن pH قد أصبح قاعدياً جداً لنمو الخلايا الصحي، فقد يكون الوقت قد حان لتغيير أسطوانة CO2 بالإضافة إلى تغيير الوسط.
تلتصق معظم السلالات الخلوية الملتصقة بشكل طبيعي بالبلاستيك غير المطلي. لذلك، تُستخدم أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية، مثل أطباق بتري أو الأطباق ذات الـ 6 آبار، بشكل متكرر لاستزراع الخلايا الفرعي.
تُستخدم أيضاً دوارق زراعة الخلايا البلاستيكية. على سبيل المثال، يُستخدم دورق زراعة الخلايا T25 غالباً لتوسيع مجموعات السلالات الخلوية الصغيرة أو لبدء نمو سلالة خلوية تتوسع ببطء. أما دوارق الزراعة T75 فتُستخدم عادةً للسلالات الخلوية التي تتكاثر بسرعة أكبر أو لإنتاج أعداد أكبر من الخلايا مما يمكن أن يتسع له دورق T25.
عند إزالة الخلايا الملتصقة، يجب أولاً شطر البروتينات التي تربط الخلايا بالبلاستيك. لهذا الغرض، يُستخدم إنزيم التريپسين الهاضم بشكل متكرر. ومن المهم توقيت التعرض للتريپسين بدقة، حيث أن المعالجة لفترة طويلة جداً يمكن أن تؤدي إلى تلف بروتينات سطح الخلية الأخرى.
يمكن أن تحتوي أوساط زراعة الخلايا على معادِلات للتريپسين. لذلك، غالباً ما يُستخدم المحلول الملحي المنظم بالفوسفات، أو PBS، لغسل الخلايا قبل عملية التريپسنة.
يُستخدم EDTA، وهو مخلب للكالسيوم، أحياناً أيضاً لتعزيز الوظيفة المحللة للبروتين للتريپسين.
من أجل توسيع المستعمرة الخلوية، يتم بعد ذلك تنمية الخلايا الممررة حديثاً في حاضنة زراعة الخلايا تحت الظروف المناسبة لتلك السلالة الخلوية، وعادة ما تكون عند حوالي 37 C، و5% CO2، ورطوبة 95%.
قبل البدء، من المهم معرفة عدد مرات مراقبة الخلايا، وهو أمر يعتمد على سرعة تكاثر هذه الخلايا.
الآن، وبعد أن أصبح لون الوسط الغذائي برتقاليًا، افحص ظروف الزرع الأخرى، مثل ما إذا كان المزرعة عكرة - وهو ما قد يشير إلى حدوث تلوث - بالإضافة إلى حجم وكثافة مستعمرات الخلايا والجودة العامة للخلايا.
إذا وصلت الخلايا إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 90%، قم بإزالة وسط زراعة الأنسجة واغسل الخلايا باستخدام PBS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم.
أضف الآن التربسين إلى الخلايا ثم قم بحضنها عند 37 C. وبعد حوالي 5 دقائق، تأكد من انفصال الخلايا، ثم أوقف عملية التحلل البروتيني بإضافة وسط زراعة أنسجة جديد.
انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي لإجراء عملية الطرد المركزي. بعد ترسيب الخلايا، قم بإزالة السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط غذائي جديد. قم بعدد الخلايا التي جمعتها، ثم ازرع الخلايا وفقًا للكثافة المناسبة للتوسيع الفوري أو اللاحق.
بعد أن تعرفت على كيفية تمرير الخلايا، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة.
كما ذكرنا سابقاً، تعد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية نوعاً من الخلايا التي يجب تمريرها. وعادة ما يتم استزراعها بشكل مشترك مع أرومات ليفية جنينية للفئران، أو MEFs، والتي توفر عوامل تساعد الخلايا الجذعية على الاحتفاظ بحالتها متعددة القدرات.
يجب "التقاط" مستعمرات الخلايا الجذعية المزروعة على خلايا مغذية بمجرد وصولها إلى مرحلة النمو المناسبة. ويمكن اختيارها باستخدام الماصة الدقيقة أو عن طريق الكشط اللطيف باستخدام أداة التقاط زجاجية، ثم زرعها في مزرعة جديدة للتوسيع.
تكون بعض الخطوط الخلوية حساسة للهضم الإنزيمي أو تكون ملتصقة بشدة لدرجة أنه لا يمكن إعادة تعليقها بمعالجة التريبسين وحدها. يمكن استخدام كاشطة الخلايا لإزالة الخلايا بلطف من قاع طبق المزرعة. وإذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل خاص، فحاول تحريك ماصة سيرولوجية بحركة كشط قوية مع شطف قاع وعاء الخلايا بالوسط أو بمحلول مناسب آخر. توخ الحذر عند استخدام هذه الطريقة، حيث يمكن أن تتضرر الخلايا الرقيقة بسبب طريقة الفصل الميكانيكية هذه.
من أجل زيادة توسيع خلاياك بشكل أسرع وأكثر قابلية للتكرار مما يمكن تحقيقه في الدوارق أحادية الطبقة، يمكن استخدام الدوارق متعددة الطبقات، والتي يمكنها توسيع المزارع الخلوية بمقدار 3-5 أضعاف مقارنة بالدوارق أحادية الطبقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول تمرير الخلايا. استعرضنا في هذا الفيديو ماهية الخط الخلوي، وكيفية استزراعه فرعياً، وبعض التطبيقات المختلفة لتمرير الخلايا. شكراً للمشاهدة، وتذكر أن تحافظ على تجديد الوسط الغذائي!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
تعد عملية تمرير الخلايا، أو الاستزراع الفرعي، إجراءً شائعاً يتم فيه تقسيم الخلايا من مزرعة معينة، أو "فصلها"، إلى مزارع جديدة وتغذيتها بأوساط نمو طازجة لتسهيل المزيد من التوسع. وبينما يبدو المفهوم في حد ذاته بسيطاً نسبياً، سنناقش في هذا الفيديو بعض الخطوات الأكثر أهمية للحفاظ الناجح على الخطوط الخلوية وتوسيعها.
تتراكم النواتج الأيضية السامة في أوساط زراعة الخلايا بمرور الوقت. وعند زيادة عدد الخلايا، يكون من المهم بشكل خاص تغيير الوسط الزراعي بانتظام للحفاظ على صحة الخلايا ومراقبة تمددها لتجنب النمو المفرط للخلايا.
بشكل عام، يتم إجراء الزراعة الفرعية لنوعين رئيسيين من الخلايا: الخطوط الخلوية الخالدة وخطوط الخلايا الجذعية
الخطوط الخلوية الخالدة هي خلايا مشتقة من كائنات متعددة الخلايا تعرضت لنوع من الطفرات التي تؤثر على تنظيم دورتها الخلوية، مما يسمح لها بالتكاثر إلى ما لا نهاية. ولعل أشهر الخطوط الخلوية الخالدة هو خط خلايا HeLa، الذي اشتق من آفة سرطان عنق الرحم وجدت في خزعة أُخذت من السيدة هنريتا لاكس في عام 1951.
وعلى عكس الخطوط الخلوية التي تكتسب الخلود بسبب السرطان، يتم توليد خطوط الخلايا الجذعية عن طريق عزل خلايا ذاتية التجدد ومتعددة القدرات من مجموعة متنوعة من الأنسجة، سواء كانت أنسجة بالغة أو جنينية. وتحت الظروف المناسبة، يمكن الحفاظ على هذه الخلايا في المزرعة إلى ما لا نهاية، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي ترونها هنا.
تُزرع الخلايا بشكل مثالي إما في حالة تعليق، مثل الخلايا الخالدة المعزولة من الدم، أو تنمو بشكل أفضل عندما تلتصق بسطح ما، كما هو الحال في العديد من الخلايا المشتقة من الأنسجة.
يجب مراقبة نمو هذه الخلايا الملتصقة بدقة لضمان صحتها. واعتماداً على نوع الخلية، تحتاج معظم الخلايا الملتصقة إلى إجراء عملية النقل (passage) عندما تصل نسبة تلاقيها (confluence) إلى 70-90%، أي عندما تغطي 70-90% من سطح وعاء الزراعة.
ضع في اعتبارك أن الخطوط الخلوية تحتفظ بالعديد من خصائص المزرعة الخلوية الأصلية، ولكن مع كل عملية نقل متتالية، قد تبدأ أيضاً في اكتساب خصائص فريدة بالمزرعة المتمددة. لذا، يرجى النظر في تحديد عدد مرات الاستمرار في نقل المزرعة الخلوية الواحدة.
عند تمرير الخلايا، من المهم استخدام تقنية معقمة والكواشف والمعدات المناسبة.
من الضروري استخدام الأوساط المناسبة لتحقيق النمو والتوسع الأمثل لسلالة الخلايا الخاصة بك. ستتطلب كل سلالة خلوية مزيجاً محدداً من مكملات النمو، ومع ذلك، تتطلب معظم السلالات الخلوية كحد أدنى المكملات التالية: المصل، مثل مصل الجنين البقري، والذي يجب معالجته حرارياً لتعطيل المتمم البقري والذي يوفر عوامل نمو حيوية للخلايا، والمضادات الحيوية، مثل البنسلين والستريبتومايسين، التي تساعد في الحد من نمو الملوثات في المزرعة، وعوامل نمو أخرى، مثل عامل نمو الخلايا الليفية، للمساعدة في إطالة نمو وتوسع السلالات الخلوية. احفظ أوساط زراعة الخلايا المكملة، أو "الكاملة"، عند 4 C عندما لا تكون قيد الاستخدام.
أولاً، لاحظ لون أوساط زراعة الأنسجة. تكون أوساط زراعة الخلايا الطازجة غنية بالمغذيات وتظهر بلون برتقالي صافٍ، ويرجع ذلك جزئياً إلى إضافة مؤشر pH، وهو الفينول الأحمر.
عندما تبدأ الخلايا في استهلاك المغذيات الموجودة في الوسط، تبدأ الفضلات والأحماض في التراكم في المزرعة الخلوية، مما يؤدي إلى خفض pH. لهذا السبب، تحتوي العديد من أوساط زراعة الأنسجة على الفينول الأحمر، الذي يحول لون الوسط من البرتقالي إلى الأصفر عندما تجعل الخلايا المزرعة حمضية. قم بتغيير الوسط قبل أن يتحول إلى هذا اللون!
عندما يحول الفينول الأحمر لون الوسط إلى اللون الوردي، مما يشير إلى أن pH قد أصبح قاعدياً جداً لنمو الخلايا الصحي، فقد يكون الوقت قد حان لتغيير أسطوانة CO2 بالإضافة إلى تغيير الوسط.
تلتصق معظم السلالات الخلوية الملتصقة بشكل طبيعي بالبلاستيك غير المطلي. لذلك، تُستخدم أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية، مثل أطباق بتري أو الأطباق ذات الـ 6 آبار، بشكل متكرر لاستزراع الخلايا الفرعي.
تُستخدم أيضاً دوارق زراعة الخلايا البلاستيكية. على سبيل المثال، يُستخدم دورق زراعة الخلايا T25 غالباً لتوسيع مجموعات السلالات الخلوية الصغيرة أو لبدء نمو سلالة خلوية تتوسع ببطء. أما دوارق الزراعة T75 فتُستخدم عادةً للسلالات الخلوية التي تتكاثر بسرعة أكبر أو لإنتاج أعداد أكبر من الخلايا مما يمكن أن يتسع له دورق T25.
عند إزالة الخلايا الملتصقة، يجب أولاً شطر البروتينات التي تربط الخلايا بالبلاستيك. لهذا الغرض، يُستخدم إنزيم التريپسين الهاضم بشكل متكرر. ومن المهم توقيت التعرض للتريپسين بدقة، حيث أن المعالجة لفترة طويلة جداً يمكن أن تؤدي إلى تلف بروتينات سطح الخلية الأخرى.
يمكن أن تحتوي أوساط زراعة الخلايا على معادِلات للتريپسين. لذلك، غالباً ما يُستخدم المحلول الملحي المنظم بالفوسفات، أو PBS، لغسل الخلايا قبل عملية التريپسنة.
يُستخدم EDTA، وهو مخلب للكالسيوم، أحياناً أيضاً لتعزيز الوظيفة المحللة للبروتين للتريپسين.
من أجل توسيع المستعمرة الخلوية، يتم بعد ذلك تنمية الخلايا الممررة حديثاً في حاضنة زراعة الخلايا تحت الظروف المناسبة لتلك السلالة الخلوية، وعادة ما تكون عند حوالي 37 C، و5% CO2، ورطوبة 95%.
قبل البدء، من المهم معرفة عدد مرات مراقبة الخلايا، وهو أمر يعتمد على سرعة تكاثر هذه الخلايا.
الآن، وبعد أن أصبح لون الوسط الغذائي برتقاليًا، افحص ظروف الزرع الأخرى، مثل ما إذا كان المزرعة عكرة - وهو ما قد يشير إلى حدوث تلوث - بالإضافة إلى حجم وكثافة مستعمرات الخلايا والجودة العامة للخلايا.
إذا وصلت الخلايا إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 90%، قم بإزالة وسط زراعة الأنسجة واغسل الخلايا باستخدام PBS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم.
أضف الآن التربسين إلى الخلايا ثم قم بحضنها عند 37 C. وبعد حوالي 5 دقائق، تأكد من انفصال الخلايا، ثم أوقف عملية التحلل البروتيني بإضافة وسط زراعة أنسجة جديد.
انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي لإجراء عملية الطرد المركزي. بعد ترسيب الخلايا، قم بإزالة السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط غذائي جديد. قم بعدد الخلايا التي جمعتها، ثم ازرع الخلايا وفقًا للكثافة المناسبة للتوسيع الفوري أو اللاحق.
بعد أن تعرفت على كيفية تمرير الخلايا، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة.
كما ذكرنا سابقاً، تعد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية نوعاً من الخلايا التي يجب تمريرها. وعادة ما يتم استزراعها بشكل مشترك مع أرومات ليفية جنينية للفئران، أو MEFs، والتي توفر عوامل تساعد الخلايا الجذعية على الاحتفاظ بحالتها متعددة القدرات.
يجب "التقاط" مستعمرات الخلايا الجذعية المزروعة على خلايا مغذية بمجرد وصولها إلى مرحلة النمو المناسبة. ويمكن اختيارها باستخدام الماصة الدقيقة أو عن طريق الكشط اللطيف باستخدام أداة التقاط زجاجية، ثم زرعها في مزرعة جديدة للتوسيع.
تكون بعض الخطوط الخلوية حساسة للهضم الإنزيمي أو تكون ملتصقة بشدة لدرجة أنه لا يمكن إعادة تعليقها بمعالجة التريبسين وحدها. يمكن استخدام كاشطة الخلايا لإزالة الخلايا بلطف من قاع طبق المزرعة. وإذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل خاص، فحاول تحريك ماصة سيرولوجية بحركة كشط قوية مع شطف قاع وعاء الخلايا بالوسط أو بمحلول مناسب آخر. توخ الحذر عند استخدام هذه الطريقة، حيث يمكن أن تتضرر الخلايا الرقيقة بسبب طريقة الفصل الميكانيكية هذه.
من أجل زيادة توسيع خلاياك بشكل أسرع وأكثر قابلية للتكرار مما يمكن تحقيقه في الدوارق أحادية الطبقة، يمكن استخدام الدوارق متعددة الطبقات، والتي يمكنها توسيع المزارع الخلوية بمقدار 3-5 أضعاف مقارنة بالدوارق أحادية الطبقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول تمرير الخلايا. استعرضنا في هذا الفيديو ماهية الخط الخلوي، وكيفية استزراعه فرعياً، وبعض التطبيقات المختلفة لتمرير الخلايا. شكراً للمشاهدة، وتذكر أن تحافظ على تجديد الوسط الغذائي!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between immortalized cell lines and stem cell lines?
Immortalized cell lines derive from multicellular organisms with mutations affecting cell cycle regulation, allowing indefinite proliferation. Stem cell lines are generated by isolating self-renewing, multipotent cells from adult or embryonic tissues. Both can be maintained indefinitely in culture under appropriate conditions, but stem cells retain pluripotency while immortalized cells do not.
Q2: Why is it important to change cell culture media regularly?
Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time, lowering pH and reducing nutrient availability. Fresh media maintains cell health and supports continued expansion. Media color indicators like phenol red signal when changes are needed—orange indicates fresh media, yellow indicates acidic conditions requiring immediate media change, and pink suggests pH is too basic.
Q3: What does 90% confluency mean and why does it matter for cell passaging?
Confluency refers to the percentage of culture container surface covered by cells. At 90% confluency, adherent cells cover most of the container bottom and must be passaged to prevent overgrowth and maintain cell health. Monitoring confluency ensures cells are split at the optimal time for expansion and prevents toxic metabolite accumulation.
Q4: What are the essential components of complete cell culture media?
Complete media requires serum such as heat-treated Fetal Bovine Serum for growth factors, antibiotics like penicillin and streptomycin to prevent contamination, and additional growth factors such as fibroblast growth factor to prolong expansion. Each cell line requires a specific growth supplement cocktail tailored to its needs. Store complete media at 4°C when not in use.
Q5: How is trypsin used to remove adherent cells from culture plates?
Trypsin is a digestive enzyme that cleaves proteins binding cells to plastic surfaces. Cells are first washed with calcium- and magnesium-free phosphate buffered saline, then trypsin is added and incubated at 37°C for approximately 5 minutes. Careful timing is critical to avoid damaging cell surface proteins. Fresh media is added to stop proteolysis before transferring cells to a conical tube for counting using hemacytometer methods and applications.
Q6: What are alternative methods for removing cells that are too adherent for standard trypsin treatment?
For cells sensitive to enzymatic digestion or extremely adherent to plates, a cell scraper can gently remove cells from the culture container bottom. Alternatively, a serological pipette can be used in a firm scraping motion while rinsing with media. Mechanical dissociation requires care, as delicate cells can be damaged by these methods.
Q7: How can cell cultures be expanded more rapidly than single-layer flasks allow?
Multilayer flasks expand cell cultures 3-5 fold compared to single-layer flasks, enabling faster and more reproducible scale-up of cell expansion. These specialized culture vessels provide increased surface area for cell growth, making them ideal for generating large numbers of cells efficiently while maintaining appropriate culture conditions.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:40
Basic Principles of Subculturing Cells
2:59
Common Equipment/Reagents for Passaging Cells
6:36
How to Passage Cells
8:03
Applications
9:36
Summary