التحول البكتيري: التثقيب الكهربائي
يعد التحول البكتيري عملية تحدث بشكل طبيعي، حيث تبتلع البكتيريا حمضاً نووياً غريباً (DNA) ثم تقوم بتضخيمه أو استنساخه. وفي المختبر، يمكن تحفيز هذه العملية صناعياً باستخدام نبضات مجال كهربائي عالي الجهد لإنشاء مسام في غشاء الخلية البكتيرية، يمكن من خلالها مرور الـ plasmid DNA. ويشير مصطلح التثقيب الكهربائي (Electroporation) إلى هذه الطريقة، وسيوضح الفيديو التالي مبادئها، وإجراءاتها خطوة بخطوة، وتطبيقاتها.
قبل أن نتحدث عن التثقيب الكهربائي للبكتيريا، من المهم فهم نوع الحمض النووي DNA المستخدم في هذه التجارب: البلازميد. البلازميد هو قطعة صغيرة دائرية من الحمض النووي DNA خارج الكروموسومات، تعمل كناقل يحمل تتابع الحمض النووي DNA المحدد الخاص بك.
سواء كان هذا التتابع جينًا لبروتين فلوري في قناديل البحر أو إنزيمًا من النباتات، فإنه يتم إدخاله في البلازميد عبر منطقة تسمى موقع الاستنساخ المتعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تتابعات محددة يتم قطعها بواسطة إنزيمات القطع الداخلية أو إنزيمات القطع. ويمكن استخدام إنزيمات القطع نفسها لقص التتابع الذي تهتم به بحيث تكون النهايات مكملة للنهايات المقطوعة حديثًا في البلازميد.
تحتوي البلازميدات أيضًا على أصل التضاعف، ويُرمز له بـ ORI، والذي يحدد النقطة التي سيبدأ عندها التضاعف. وعندما يتعلق الأمر بالتحول البكتيري، يكون جين مقاومة المضادات الحيوية ذا أهمية حيوية؛ فكما يشير اسمه، يسمح هذا الجين للبكتيريا بإنتاج إنزيم يبطل مفعول المضاد الحيوي، مما يمكنها من البقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية.
تعتمد عملية التثقيب الكهربائي على جهاز متخصص يسمى جهاز التثقيب الكهربائي (electroporator). وعادةً ما توضع الخلايا في كوفيت تثقيب كهربائي، والتي تحتوي على أقطاب كهربائية على كل جانب تضمن التلامس الكهربائي مع الجهاز بمجرد إدخالها.
يتم تحميل الخلايا البكتيرية المخلوطة بـ DNA في كوفيت التثقيب الكهربائي، ثم يُسلط مجال كهربائي يتراوح ما بين 1000 إلى 10,000 فولت لكل سنتيمتر لبضع مللي ثانية. يؤدي ذلك إلى وصول الجهد عبر الغشاء إلى 0.5-1 فولت، وهو ما يُعتقد أنه يؤدي إلى إعادة ترتيب طبقة الفوسفوليبيد الثنائية التي يتكون منها غشاء الخلية بحيث تتشكل مسام. وفي هذه الحالة، سيمر الـ plasmid DNA عبر الغشاء، وعند اكتمال النبض الكهربائي، تقوم الطبقة الثنائية بإصلاح نفسها.
بعد امتصاص الـ plasmid، يمكن للبكتيريا بعد ذلك أن تنمو على أطباق آغار تحتوي على مضاد حيوي.
بعد أن تعرفنا على البلازميدات وآلية التثقيب الكهربائي، دعونا نلقِ نظرة على كيفية تنفيذ هذا الإجراء.
تُسمى الخلايا التي يمكنها امتصاص DNA بسهولة بالخلايا المختصة (competent cells). والنوع الأكثر شيوعاً من البكتيريا المختصة التي يتم تحويلها في أبحاث البيولوجيا الجزيئية هي بكتيريا E. coli، وهي بكتيريا بدائية النواة تستوطن الأمعاء الغليظة. وتُسمى بكتيريا E. coli التي يتم تحضيرها للتثقيب الكهربائي بالخلايا المختصة كهربائياً (electrocompetent cells).
عند التعامل مع البكتيريا، تأكد من أن منطقة العمل نظيفة قدر الإمكان.
كما يتطلب التعامل مع البكتيريا ممارسة التقنيات المعقمة. ويتضمن ذلك عادةً استخدام موقد بنزن لتعقيم الأدوات ولإنشاء تيار حمل حراري، مما يبعد الملوثات المحمولة في الهواء عن مساحة العمل.
قبل التثقيب الكهربائي مباشرة، قم بتدفئة الأوساط الغذائية مسبقاً لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وارفع درجة حرارة أطباق الآغار التي تحتوي على مضاد حيوي إلى 37°C، وقم بتبريد كوفيتات التثقيب الكهربائي على الثلج.
بعد ذلك، قم بإذابة الخلايا المختصة كهربائياً والمغسولة على الثلج.
أضف 1-5uL من البلازميد البارد بتركيز 1ng/μL والخالي من الأملاح إلى الخلايا البكتيرية، واخلط بلطف، ثم أضف الخليط إلى الكوفيت الباردة. تأكد من عدم وجود فقاعات.
اضبط الجهد وقوة المجال في جهاز التثقيب الكهربائي وفقاً للإعدادات الصحيحة لخلاياك. ترى هنا جهاز تثقيب كهربائي يتم ضبطه على 1700 فولت ليعطي قوة مجال تبلغ 17kV/cm.
جفف الجزء الخارجي من الكوفيت جيداً ثم ضعها في جهاز التثقيب الكهربائي. قم بتمرير النبضة الكهربائية للخلايا حتى تسمع صوت صفارة.
يؤدي فشل النبضة إلى حدوث تفريغ كهربائي، يظهر على شكل شرارة مرئية وصوت فرقعة مسموع. هذا التفريغ، الذي يُعرف باسم القوس الكهربائي (arcing)، قد يكون نتيجة لوجود كمية كبيرة من الأملاح في الخلايا المختصة أو في DNA.
يمكن التنبؤ بنجاح عملية التحول من خلال ملاحظة الثابت الزمني، وهو المدة التي يستغرقها الجهد ليتلاشى بعد تطبيق النبضة. عندما يكون الملح موجوداً ويكون محلول التثقيب الكهربائي موصلاً جداً للكهرباء، يحدث التلاشي بسرعة، مما يسبب التفريغ، وبالتالي يؤدي إلى قتل العديد من خلاياك. بالنسبة للبكتيريا، تتراوح الثوابت الزمنية الجيدة بين 5-10 milliseconds.
بعد النبض مباشرة، أخرج الكوفيت وأضف 1 ml من الوسط الغذائي مباشرة إلى الخلايا. يتم وضع هذا الوسط الذي يحتوي على الخلايا في أنبوب ويُحضن عند 37°C لمدة ساعة واحدة مع الرج، وذلك لكي تتعافى الخلايا.
بعد ذلك، وباستخدام التقنيات المعقمة، أضف 20-200uL من الخلايا إلى طبق آغار يحتوي على مضاد حيوي. اقلب الأطباق بحيث يكون الآغار في الأعلى لضمان عدم سقوط التكاثف على خلاياك، ثم حضنها طوال الليل عند 37°C.
يجب أن تشكل البكتيريا التي تم تحويلها بالبلازميد مستعمرات. قم بعد المستعمرات واحسب كفاءة التحول، وهي عدد المحولات الناجحة مقسومة على الكمية الإجمالية من DNA التي تم زرعها في الأطباق.
يجب تحضير الآجار والأوساط الغذائية مسبقاً، والتي توفر التغذية للبكتيريا، وتعقيمها بواسطة الموصدة (autoclave). اترك الأوساط السائلة لتبرد حتى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، واترك الآجار ليبرد حتى 50-55˚C – وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وصب الأطباق. بعد ذلك، اترك الأطباق لتبرد حتى درجة حرارة الغرفة لتتصلب.
بما أن البكتيريا المستخدمة في عملية التحول تُخزن في المجمد، يجب أولاً إذابتها على الثلج، وتوزيعها على طبق آجار خالٍ من المضادات الحيوية، ثم تنميتها طوال الليل عند 37˚C.
باستخدام تقنية التعقيم، اختر مستعمرة بكتيرية من طبق الآجار وقم بتنميتها في مزرعة أكبر بحجم 500mL طوال الليل عند 37°C في حاضنة هزازة.
أثناء نمو الخلايا، قم بتحضير حوالي لتر من الماء منزوع الأيونات، وجهز محلولاً من الجلسرول والماء بتركيز 10%، حجم إلى حجم. قم بتعقيم المحاليل بالموصدة واتركها تبرد عند 4˚C.
تُستخدم قياسات الامتصاصية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في طور النمو اللوغاريتمي المتوسط (mid log phase) أم لا، وهو الطور الذي تكون فيه الخلايا مستعدة لاستقبال DNA بسهولة. وبمجرد وصول الخلايا إلى هذا الطور، ضعها على الثلج وأبقِها هناك طوال فترة الإجراء.
بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق فصلها في أنبوبي طرد مركزي كبيرين وقم بتدويرهما عند 4°C، ثم اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 100mL من الماء المعقم البارد منزوع الأيونات. كرر هذه الخطوة مرة واحدة أخرى على الأقل. الغرض من هذه الخطوة تحديداً هو إزالة الأملاح، التي قد تؤثر بقوة على تقنية التثقيب الكهربائي (electroporation).
قم بإجراء غسلتين إضافيتين في 50 ml من محلول الجلسرول 10% في الماء، وفي النهاية أعد تعليق البكتيريا في هذا المحلول نفسه.
أضف 50μL من الخلايا إلى عدة أنابيب Eppendorf. أصبحت هذه الخلايا الآن جاهزة للاستخدام في التثقيب الكهربائي ويجب حفظها عند 4˚C، أو يمكن تجميدها سريعاً وتخزينها عند -80˚C.
كما سترون، فإن للتثقيب الكهربائي تطبيقات عديدة.
ويعد التحول بالصدمة الحرارية بديلاً للتثقيب الكهربائي، وهو يعتمد على تعريض البكتيريا لكل من كلوريد الكالسيوم والحرارة من أجل إدخال DNA إلى الخلايا.
وبوجه عام، تكون الصدمة الحرارية أقل حدة على البكتيريا مقارنة بالتثقيب الكهربائي ولا تتطلب تركيزاً منخفضاً من الأملاح. ويمكن استخدام تفاعلات الربط، وهي التفاعلات التي تتضمن إدخال الجين المستهدف في البلازميد، مباشرة في عملية التحول بالصدمة الحرارية. كما أن التحول بالصدمة الحرارية أقل تكلفة من التثقيب الكهربائي ولا يعتمد على معدات أو كوفيتات باهظة الثمن. ومن ناحية أخرى، تؤدي الصدمة الحرارية إلى كفاءات تحول أقل من التثقيب الكهربائي وتستغرق وقتاً أطول. كما أنها تقتصر على البكتيريا والخمائر والبروتوبلاست النباتية، بينما يمكن تطبيق التثقيب الكهربائي على الخلايا الثديية.
ترون هنا تحميل الخلايا الليفية الجنينية للفأر في كوفيتة تثقيب كهربائي. وبمجرد اكتمال عملية التثقيب الكهربائي، يمكن تحديد كفاءات التحول من خلال مراقبة مدى إنتاج الخلايا لبروتين الفلوريسنت الأخضر المشفر بواسطة البلازميد. ويطلق مصطلح "العدوى" (Transfection) على عملية تحول الخلايا الثديية، والتي تتطلب عادةً شدة مجال كهربائي أقل من الخلايا البكتيرية وثوابت زمنية أعلى.
يمكن أيضاً إجراء التثقيب الكهربائي في حيوانات كاملة، مثل جنين الدجاج النامي الذي ترونه هنا؛ حيث يتم حقن DNA البلازميد في دماغ الصوص، ثم يُستخدم مسبار التثقيب الكهربائي لتطبيق مجال كهربائي على أنسجة الدماغ. وبعد يوم أو يومين، تقوم العصبونات بإنتاج بروتينات فلورية خضراء وحمراء - مشفرة بواسطة البلازميد - وبذلك يستطيع العلماء مراقبة التغيرات الهيكلية في دماغ الصوص النامي.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول التحول البكتيري بواسطة التثقيب الكهربائي. قدم هذا الفيديو البلازميد باعتباره النوع الأكثر شيوعاً من الحمض النووي DNA الذي يتم تحويله، وناقش الآلية الفيزيائية الحيوية التي يُعتقد أنها تكمن وراء التثقيب الكهربائي، وعرض إجراءً عاماً لتنفيذ التثقيب الكهربائي، ووصف كيفية استخدام التثقيب الكهربائي في الأنظمة الثديية. شكراً للمشاهدة!
يشير مصطلح "التحول" (transformation) إلى عملية ابتلاع الخلية للحمض النووي DNA الغريب. وفي الطبيعة، يمكن أن يحدث التحول في أنواع معينة من البكتيريا. أم…
يعد التحول البكتيري عملية تحدث بشكل طبيعي، حيث تبتلع البكتيريا حمضاً نووياً غريباً (DNA) ثم تقوم بتضخيمه أو استنساخه. وفي المختبر، يمكن تحفيز هذه العملية صناعياً باستخدام نبضات مجال كهربائي عالي الجهد لإنشاء مسام في غشاء الخلية البكتيرية، يمكن من خلالها مرور الـ plasmid DNA. ويشير مصطلح التثقيب الكهربائي (Electroporation) إلى هذه الطريقة، وسيوضح الفيديو التالي مبادئها، وإجراءاتها خطوة بخطوة، وتطبيقاتها.
قبل أن نتحدث عن التثقيب الكهربائي للبكتيريا، من المهم فهم نوع الحمض النووي DNA المستخدم في هذه التجارب: البلازميد. البلازميد هو قطعة صغيرة دائرية من الحمض النووي DNA خارج الكروموسومات، تعمل كناقل يحمل تتابع الحمض النووي DNA المحدد الخاص بك.
سواء كان هذا التتابع جينًا لبروتين فلوري في قناديل البحر أو إنزيمًا من النباتات، فإنه يتم إدخاله في البلازميد عبر منطقة تسمى موقع الاستنساخ المتعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تتابعات محددة يتم قطعها بواسطة إنزيمات القطع الداخلية أو إنزيمات القطع. ويمكن استخدام إنزيمات القطع نفسها لقص التتابع الذي تهتم به بحيث تكون النهايات مكملة للنهايات المقطوعة حديثًا في البلازميد.
تحتوي البلازميدات أيضًا على أصل التضاعف، ويُرمز له بـ ORI، والذي يحدد النقطة التي سيبدأ عندها التضاعف. وعندما يتعلق الأمر بالتحول البكتيري، يكون جين مقاومة المضادات الحيوية ذا أهمية حيوية؛ فكما يشير اسمه، يسمح هذا الجين للبكتيريا بإنتاج إنزيم يبطل مفعول المضاد الحيوي، مما يمكنها من البقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية.
تعتمد عملية التثقيب الكهربائي على جهاز متخصص يسمى جهاز التثقيب الكهربائي (electroporator). وعادةً ما توضع الخلايا في كوفيت تثقيب كهربائي، والتي تحتوي على أقطاب كهربائية على كل جانب تضمن التلامس الكهربائي مع الجهاز بمجرد إدخالها.
يتم تحميل الخلايا البكتيرية المخلوطة بـ DNA في كوفيت التثقيب الكهربائي، ثم يُسلط مجال كهربائي يتراوح ما بين 1000 إلى 10,000 فولت لكل سنتيمتر لبضع مللي ثانية. يؤدي ذلك إلى وصول الجهد عبر الغشاء إلى 0.5-1 فولت، وهو ما يُعتقد أنه يؤدي إلى إعادة ترتيب طبقة الفوسفوليبيد الثنائية التي يتكون منها غشاء الخلية بحيث تتشكل مسام. وفي هذه الحالة، سيمر الـ plasmid DNA عبر الغشاء، وعند اكتمال النبض الكهربائي، تقوم الطبقة الثنائية بإصلاح نفسها.
بعد امتصاص الـ plasmid، يمكن للبكتيريا بعد ذلك أن تنمو على أطباق آغار تحتوي على مضاد حيوي.
بعد أن تعرفنا على البلازميدات وآلية التثقيب الكهربائي، دعونا نلقِ نظرة على كيفية تنفيذ هذا الإجراء.
تُسمى الخلايا التي يمكنها امتصاص DNA بسهولة بالخلايا المختصة (competent cells). والنوع الأكثر شيوعاً من البكتيريا المختصة التي يتم تحويلها في أبحاث البيولوجيا الجزيئية هي بكتيريا E. coli، وهي بكتيريا بدائية النواة تستوطن الأمعاء الغليظة. وتُسمى بكتيريا E. coli التي يتم تحضيرها للتثقيب الكهربائي بالخلايا المختصة كهربائياً (electrocompetent cells).
عند التعامل مع البكتيريا، تأكد من أن منطقة العمل نظيفة قدر الإمكان.
كما يتطلب التعامل مع البكتيريا ممارسة التقنيات المعقمة. ويتضمن ذلك عادةً استخدام موقد بنزن لتعقيم الأدوات ولإنشاء تيار حمل حراري، مما يبعد الملوثات المحمولة في الهواء عن مساحة العمل.
قبل التثقيب الكهربائي مباشرة، قم بتدفئة الأوساط الغذائية مسبقاً لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وارفع درجة حرارة أطباق الآغار التي تحتوي على مضاد حيوي إلى 37°C، وقم بتبريد كوفيتات التثقيب الكهربائي على الثلج.
بعد ذلك، قم بإذابة الخلايا المختصة كهربائياً والمغسولة على الثلج.
أضف 1-5uL من البلازميد البارد بتركيز 1ng/μL والخالي من الأملاح إلى الخلايا البكتيرية، واخلط بلطف، ثم أضف الخليط إلى الكوفيت الباردة. تأكد من عدم وجود فقاعات.
اضبط الجهد وقوة المجال في جهاز التثقيب الكهربائي وفقاً للإعدادات الصحيحة لخلاياك. ترى هنا جهاز تثقيب كهربائي يتم ضبطه على 1700 فولت ليعطي قوة مجال تبلغ 17kV/cm.
جفف الجزء الخارجي من الكوفيت جيداً ثم ضعها في جهاز التثقيب الكهربائي. قم بتمرير النبضة الكهربائية للخلايا حتى تسمع صوت صفارة.
يؤدي فشل النبضة إلى حدوث تفريغ كهربائي، يظهر على شكل شرارة مرئية وصوت فرقعة مسموع. هذا التفريغ، الذي يُعرف باسم القوس الكهربائي (arcing)، قد يكون نتيجة لوجود كمية كبيرة من الأملاح في الخلايا المختصة أو في DNA.
يمكن التنبؤ بنجاح عملية التحول من خلال ملاحظة الثابت الزمني، وهو المدة التي يستغرقها الجهد ليتلاشى بعد تطبيق النبضة. عندما يكون الملح موجوداً ويكون محلول التثقيب الكهربائي موصلاً جداً للكهرباء، يحدث التلاشي بسرعة، مما يسبب التفريغ، وبالتالي يؤدي إلى قتل العديد من خلاياك. بالنسبة للبكتيريا، تتراوح الثوابت الزمنية الجيدة بين 5-10 milliseconds.
بعد النبض مباشرة، أخرج الكوفيت وأضف 1 ml من الوسط الغذائي مباشرة إلى الخلايا. يتم وضع هذا الوسط الذي يحتوي على الخلايا في أنبوب ويُحضن عند 37°C لمدة ساعة واحدة مع الرج، وذلك لكي تتعافى الخلايا.
بعد ذلك، وباستخدام التقنيات المعقمة، أضف 20-200uL من الخلايا إلى طبق آغار يحتوي على مضاد حيوي. اقلب الأطباق بحيث يكون الآغار في الأعلى لضمان عدم سقوط التكاثف على خلاياك، ثم حضنها طوال الليل عند 37°C.
يجب أن تشكل البكتيريا التي تم تحويلها بالبلازميد مستعمرات. قم بعد المستعمرات واحسب كفاءة التحول، وهي عدد المحولات الناجحة مقسومة على الكمية الإجمالية من DNA التي تم زرعها في الأطباق.
يجب تحضير الآجار والأوساط الغذائية مسبقاً، والتي توفر التغذية للبكتيريا، وتعقيمها بواسطة الموصدة (autoclave). اترك الأوساط السائلة لتبرد حتى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، واترك الآجار ليبرد حتى 50-55˚C – وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وصب الأطباق. بعد ذلك، اترك الأطباق لتبرد حتى درجة حرارة الغرفة لتتصلب.
بما أن البكتيريا المستخدمة في عملية التحول تُخزن في المجمد، يجب أولاً إذابتها على الثلج، وتوزيعها على طبق آجار خالٍ من المضادات الحيوية، ثم تنميتها طوال الليل عند 37˚C.
باستخدام تقنية التعقيم، اختر مستعمرة بكتيرية من طبق الآجار وقم بتنميتها في مزرعة أكبر بحجم 500mL طوال الليل عند 37°C في حاضنة هزازة.
أثناء نمو الخلايا، قم بتحضير حوالي لتر من الماء منزوع الأيونات، وجهز محلولاً من الجلسرول والماء بتركيز 10%، حجم إلى حجم. قم بتعقيم المحاليل بالموصدة واتركها تبرد عند 4˚C.
تُستخدم قياسات الامتصاصية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في طور النمو اللوغاريتمي المتوسط (mid log phase) أم لا، وهو الطور الذي تكون فيه الخلايا مستعدة لاستقبال DNA بسهولة. وبمجرد وصول الخلايا إلى هذا الطور، ضعها على الثلج وأبقِها هناك طوال فترة الإجراء.
بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق فصلها في أنبوبي طرد مركزي كبيرين وقم بتدويرهما عند 4°C، ثم اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 100mL من الماء المعقم البارد منزوع الأيونات. كرر هذه الخطوة مرة واحدة أخرى على الأقل. الغرض من هذه الخطوة تحديداً هو إزالة الأملاح، التي قد تؤثر بقوة على تقنية التثقيب الكهربائي (electroporation).
قم بإجراء غسلتين إضافيتين في 50 ml من محلول الجلسرول 10% في الماء، وفي النهاية أعد تعليق البكتيريا في هذا المحلول نفسه.
أضف 50μL من الخلايا إلى عدة أنابيب Eppendorf. أصبحت هذه الخلايا الآن جاهزة للاستخدام في التثقيب الكهربائي ويجب حفظها عند 4˚C، أو يمكن تجميدها سريعاً وتخزينها عند -80˚C.
كما سترون، فإن للتثقيب الكهربائي تطبيقات عديدة.
ويعد التحول بالصدمة الحرارية بديلاً للتثقيب الكهربائي، وهو يعتمد على تعريض البكتيريا لكل من كلوريد الكالسيوم والحرارة من أجل إدخال DNA إلى الخلايا.
وبوجه عام، تكون الصدمة الحرارية أقل حدة على البكتيريا مقارنة بالتثقيب الكهربائي ولا تتطلب تركيزاً منخفضاً من الأملاح. ويمكن استخدام تفاعلات الربط، وهي التفاعلات التي تتضمن إدخال الجين المستهدف في البلازميد، مباشرة في عملية التحول بالصدمة الحرارية. كما أن التحول بالصدمة الحرارية أقل تكلفة من التثقيب الكهربائي ولا يعتمد على معدات أو كوفيتات باهظة الثمن. ومن ناحية أخرى، تؤدي الصدمة الحرارية إلى كفاءات تحول أقل من التثقيب الكهربائي وتستغرق وقتاً أطول. كما أنها تقتصر على البكتيريا والخمائر والبروتوبلاست النباتية، بينما يمكن تطبيق التثقيب الكهربائي على الخلايا الثديية.
ترون هنا تحميل الخلايا الليفية الجنينية للفأر في كوفيتة تثقيب كهربائي. وبمجرد اكتمال عملية التثقيب الكهربائي، يمكن تحديد كفاءات التحول من خلال مراقبة مدى إنتاج الخلايا لبروتين الفلوريسنت الأخضر المشفر بواسطة البلازميد. ويطلق مصطلح "العدوى" (Transfection) على عملية تحول الخلايا الثديية، والتي تتطلب عادةً شدة مجال كهربائي أقل من الخلايا البكتيرية وثوابت زمنية أعلى.
يمكن أيضاً إجراء التثقيب الكهربائي في حيوانات كاملة، مثل جنين الدجاج النامي الذي ترونه هنا؛ حيث يتم حقن DNA البلازميد في دماغ الصوص، ثم يُستخدم مسبار التثقيب الكهربائي لتطبيق مجال كهربائي على أنسجة الدماغ. وبعد يوم أو يومين، تقوم العصبونات بإنتاج بروتينات فلورية خضراء وحمراء - مشفرة بواسطة البلازميد - وبذلك يستطيع العلماء مراقبة التغيرات الهيكلية في دماغ الصوص النامي.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول التحول البكتيري بواسطة التثقيب الكهربائي. قدم هذا الفيديو البلازميد باعتباره النوع الأكثر شيوعاً من الحمض النووي DNA الذي يتم تحويله، وناقش الآلية الفيزيائية الحيوية التي يُعتقد أنها تكمن وراء التثقيب الكهربائي، وعرض إجراءً عاماً لتنفيذ التثقيب الكهربائي، ووصف كيفية استخدام التثقيب الكهربائي في الأنظمة الثديية. شكراً للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يعد التحول البكتيري عملية تحدث بشكل طبيعي، حيث تبتلع البكتيريا حمضاً نووياً غريباً (DNA) ثم تقوم بتضخيمه أو استنساخه. وفي المختبر، يمكن تحفيز هذه العملية صناعياً باستخدام نبضات مجال كهربائي عالي الجهد لإنشاء مسام في غشاء الخلية البكتيرية، يمكن من خلالها مرور الـ plasmid DNA. ويشير مصطلح التثقيب الكهربائي (Electroporation) إلى هذه الطريقة، وسيوضح الفيديو التالي مبادئها، وإجراءاتها خطوة بخطوة، وتطبيقاتها.
قبل أن نتحدث عن التثقيب الكهربائي للبكتيريا، من المهم فهم نوع الحمض النووي DNA المستخدم في هذه التجارب: البلازميد. البلازميد هو قطعة صغيرة دائرية من الحمض النووي DNA خارج الكروموسومات، تعمل كناقل يحمل تتابع الحمض النووي DNA المحدد الخاص بك.
سواء كان هذا التتابع جينًا لبروتين فلوري في قناديل البحر أو إنزيمًا من النباتات، فإنه يتم إدخاله في البلازميد عبر منطقة تسمى موقع الاستنساخ المتعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تتابعات محددة يتم قطعها بواسطة إنزيمات القطع الداخلية أو إنزيمات القطع. ويمكن استخدام إنزيمات القطع نفسها لقص التتابع الذي تهتم به بحيث تكون النهايات مكملة للنهايات المقطوعة حديثًا في البلازميد.
تحتوي البلازميدات أيضًا على أصل التضاعف، ويُرمز له بـ ORI، والذي يحدد النقطة التي سيبدأ عندها التضاعف. وعندما يتعلق الأمر بالتحول البكتيري، يكون جين مقاومة المضادات الحيوية ذا أهمية حيوية؛ فكما يشير اسمه، يسمح هذا الجين للبكتيريا بإنتاج إنزيم يبطل مفعول المضاد الحيوي، مما يمكنها من البقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية.
تعتمد عملية التثقيب الكهربائي على جهاز متخصص يسمى جهاز التثقيب الكهربائي (electroporator). وعادةً ما توضع الخلايا في كوفيت تثقيب كهربائي، والتي تحتوي على أقطاب كهربائية على كل جانب تضمن التلامس الكهربائي مع الجهاز بمجرد إدخالها.
يتم تحميل الخلايا البكتيرية المخلوطة بـ DNA في كوفيت التثقيب الكهربائي، ثم يُسلط مجال كهربائي يتراوح ما بين 1000 إلى 10,000 فولت لكل سنتيمتر لبضع مللي ثانية. يؤدي ذلك إلى وصول الجهد عبر الغشاء إلى 0.5-1 فولت، وهو ما يُعتقد أنه يؤدي إلى إعادة ترتيب طبقة الفوسفوليبيد الثنائية التي يتكون منها غشاء الخلية بحيث تتشكل مسام. وفي هذه الحالة، سيمر الـ plasmid DNA عبر الغشاء، وعند اكتمال النبض الكهربائي، تقوم الطبقة الثنائية بإصلاح نفسها.
بعد امتصاص الـ plasmid، يمكن للبكتيريا بعد ذلك أن تنمو على أطباق آغار تحتوي على مضاد حيوي.
بعد أن تعرفنا على البلازميدات وآلية التثقيب الكهربائي، دعونا نلقِ نظرة على كيفية تنفيذ هذا الإجراء.
تُسمى الخلايا التي يمكنها امتصاص DNA بسهولة بالخلايا المختصة (competent cells). والنوع الأكثر شيوعاً من البكتيريا المختصة التي يتم تحويلها في أبحاث البيولوجيا الجزيئية هي بكتيريا E. coli، وهي بكتيريا بدائية النواة تستوطن الأمعاء الغليظة. وتُسمى بكتيريا E. coli التي يتم تحضيرها للتثقيب الكهربائي بالخلايا المختصة كهربائياً (electrocompetent cells).
عند التعامل مع البكتيريا، تأكد من أن منطقة العمل نظيفة قدر الإمكان.
كما يتطلب التعامل مع البكتيريا ممارسة التقنيات المعقمة. ويتضمن ذلك عادةً استخدام موقد بنزن لتعقيم الأدوات ولإنشاء تيار حمل حراري، مما يبعد الملوثات المحمولة في الهواء عن مساحة العمل.
قبل التثقيب الكهربائي مباشرة، قم بتدفئة الأوساط الغذائية مسبقاً لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وارفع درجة حرارة أطباق الآغار التي تحتوي على مضاد حيوي إلى 37°C، وقم بتبريد كوفيتات التثقيب الكهربائي على الثلج.
بعد ذلك، قم بإذابة الخلايا المختصة كهربائياً والمغسولة على الثلج.
أضف 1-5uL من البلازميد البارد بتركيز 1ng/μL والخالي من الأملاح إلى الخلايا البكتيرية، واخلط بلطف، ثم أضف الخليط إلى الكوفيت الباردة. تأكد من عدم وجود فقاعات.
اضبط الجهد وقوة المجال في جهاز التثقيب الكهربائي وفقاً للإعدادات الصحيحة لخلاياك. ترى هنا جهاز تثقيب كهربائي يتم ضبطه على 1700 فولت ليعطي قوة مجال تبلغ 17kV/cm.
جفف الجزء الخارجي من الكوفيت جيداً ثم ضعها في جهاز التثقيب الكهربائي. قم بتمرير النبضة الكهربائية للخلايا حتى تسمع صوت صفارة.
يؤدي فشل النبضة إلى حدوث تفريغ كهربائي، يظهر على شكل شرارة مرئية وصوت فرقعة مسموع. هذا التفريغ، الذي يُعرف باسم القوس الكهربائي (arcing)، قد يكون نتيجة لوجود كمية كبيرة من الأملاح في الخلايا المختصة أو في DNA.
يمكن التنبؤ بنجاح عملية التحول من خلال ملاحظة الثابت الزمني، وهو المدة التي يستغرقها الجهد ليتلاشى بعد تطبيق النبضة. عندما يكون الملح موجوداً ويكون محلول التثقيب الكهربائي موصلاً جداً للكهرباء، يحدث التلاشي بسرعة، مما يسبب التفريغ، وبالتالي يؤدي إلى قتل العديد من خلاياك. بالنسبة للبكتيريا، تتراوح الثوابت الزمنية الجيدة بين 5-10 milliseconds.
بعد النبض مباشرة، أخرج الكوفيت وأضف 1 ml من الوسط الغذائي مباشرة إلى الخلايا. يتم وضع هذا الوسط الذي يحتوي على الخلايا في أنبوب ويُحضن عند 37°C لمدة ساعة واحدة مع الرج، وذلك لكي تتعافى الخلايا.
بعد ذلك، وباستخدام التقنيات المعقمة، أضف 20-200uL من الخلايا إلى طبق آغار يحتوي على مضاد حيوي. اقلب الأطباق بحيث يكون الآغار في الأعلى لضمان عدم سقوط التكاثف على خلاياك، ثم حضنها طوال الليل عند 37°C.
يجب أن تشكل البكتيريا التي تم تحويلها بالبلازميد مستعمرات. قم بعد المستعمرات واحسب كفاءة التحول، وهي عدد المحولات الناجحة مقسومة على الكمية الإجمالية من DNA التي تم زرعها في الأطباق.
يجب تحضير الآجار والأوساط الغذائية مسبقاً، والتي توفر التغذية للبكتيريا، وتعقيمها بواسطة الموصدة (autoclave). اترك الأوساط السائلة لتبرد حتى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، واترك الآجار ليبرد حتى 50-55˚C – وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وصب الأطباق. بعد ذلك، اترك الأطباق لتبرد حتى درجة حرارة الغرفة لتتصلب.
بما أن البكتيريا المستخدمة في عملية التحول تُخزن في المجمد، يجب أولاً إذابتها على الثلج، وتوزيعها على طبق آجار خالٍ من المضادات الحيوية، ثم تنميتها طوال الليل عند 37˚C.
باستخدام تقنية التعقيم، اختر مستعمرة بكتيرية من طبق الآجار وقم بتنميتها في مزرعة أكبر بحجم 500mL طوال الليل عند 37°C في حاضنة هزازة.
أثناء نمو الخلايا، قم بتحضير حوالي لتر من الماء منزوع الأيونات، وجهز محلولاً من الجلسرول والماء بتركيز 10%، حجم إلى حجم. قم بتعقيم المحاليل بالموصدة واتركها تبرد عند 4˚C.
تُستخدم قياسات الامتصاصية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في طور النمو اللوغاريتمي المتوسط (mid log phase) أم لا، وهو الطور الذي تكون فيه الخلايا مستعدة لاستقبال DNA بسهولة. وبمجرد وصول الخلايا إلى هذا الطور، ضعها على الثلج وأبقِها هناك طوال فترة الإجراء.
بعد ذلك، اغسل الخلايا عن طريق فصلها في أنبوبي طرد مركزي كبيرين وقم بتدويرهما عند 4°C، ثم اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 100mL من الماء المعقم البارد منزوع الأيونات. كرر هذه الخطوة مرة واحدة أخرى على الأقل. الغرض من هذه الخطوة تحديداً هو إزالة الأملاح، التي قد تؤثر بقوة على تقنية التثقيب الكهربائي (electroporation).
قم بإجراء غسلتين إضافيتين في 50 ml من محلول الجلسرول 10% في الماء، وفي النهاية أعد تعليق البكتيريا في هذا المحلول نفسه.
أضف 50μL من الخلايا إلى عدة أنابيب Eppendorf. أصبحت هذه الخلايا الآن جاهزة للاستخدام في التثقيب الكهربائي ويجب حفظها عند 4˚C، أو يمكن تجميدها سريعاً وتخزينها عند -80˚C.
كما سترون، فإن للتثقيب الكهربائي تطبيقات عديدة.
ويعد التحول بالصدمة الحرارية بديلاً للتثقيب الكهربائي، وهو يعتمد على تعريض البكتيريا لكل من كلوريد الكالسيوم والحرارة من أجل إدخال DNA إلى الخلايا.
وبوجه عام، تكون الصدمة الحرارية أقل حدة على البكتيريا مقارنة بالتثقيب الكهربائي ولا تتطلب تركيزاً منخفضاً من الأملاح. ويمكن استخدام تفاعلات الربط، وهي التفاعلات التي تتضمن إدخال الجين المستهدف في البلازميد، مباشرة في عملية التحول بالصدمة الحرارية. كما أن التحول بالصدمة الحرارية أقل تكلفة من التثقيب الكهربائي ولا يعتمد على معدات أو كوفيتات باهظة الثمن. ومن ناحية أخرى، تؤدي الصدمة الحرارية إلى كفاءات تحول أقل من التثقيب الكهربائي وتستغرق وقتاً أطول. كما أنها تقتصر على البكتيريا والخمائر والبروتوبلاست النباتية، بينما يمكن تطبيق التثقيب الكهربائي على الخلايا الثديية.
ترون هنا تحميل الخلايا الليفية الجنينية للفأر في كوفيتة تثقيب كهربائي. وبمجرد اكتمال عملية التثقيب الكهربائي، يمكن تحديد كفاءات التحول من خلال مراقبة مدى إنتاج الخلايا لبروتين الفلوريسنت الأخضر المشفر بواسطة البلازميد. ويطلق مصطلح "العدوى" (Transfection) على عملية تحول الخلايا الثديية، والتي تتطلب عادةً شدة مجال كهربائي أقل من الخلايا البكتيرية وثوابت زمنية أعلى.
يمكن أيضاً إجراء التثقيب الكهربائي في حيوانات كاملة، مثل جنين الدجاج النامي الذي ترونه هنا؛ حيث يتم حقن DNA البلازميد في دماغ الصوص، ثم يُستخدم مسبار التثقيب الكهربائي لتطبيق مجال كهربائي على أنسجة الدماغ. وبعد يوم أو يومين، تقوم العصبونات بإنتاج بروتينات فلورية خضراء وحمراء - مشفرة بواسطة البلازميد - وبذلك يستطيع العلماء مراقبة التغيرات الهيكلية في دماغ الصوص النامي.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول التحول البكتيري بواسطة التثقيب الكهربائي. قدم هذا الفيديو البلازميد باعتباره النوع الأكثر شيوعاً من الحمض النووي DNA الذي يتم تحويله، وناقش الآلية الفيزيائية الحيوية التي يُعتقد أنها تكمن وراء التثقيب الكهربائي، وعرض إجراءً عاماً لتنفيذ التثقيب الكهربائي، ووصف كيفية استخدام التثقيب الكهربائي في الأنظمة الثديية. شكراً للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector to carry your specific DNA sequence into bacterial cells. It contains a multiple cloning site where restriction enzymes insert your target gene, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that allows transformed bacteria to survive on antibiotic-containing media.
Q2: How does electroporation create pores in bacterial cell membranes?
Electroporation applies a high-voltage electric field of 1,000 to 10,000 volts per centimeter for milliseconds, causing the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts. This rearranges the phospholipid bilayer, creating temporary pores through which plasmid DNA passes. Once pulsing stops, the bilayer repairs itself, trapping the DNA inside the cell.
Q3: What are electrocompetent cells and how are they prepared?
Electrocompetent cells are bacteria prepared to readily take up DNA during electroporation. E. coli cells are grown to mid-log phase, then washed multiple times in deionized water and 10% glycerol solution to remove salt. Salt removal is critical because high salt content causes arcing, an electrical discharge that kills cells and indicates transformation failure.
Q4: Why is the time constant important in predicting electroporation success?
The time constant measures how quickly voltage decays after the electric pulse is applied. Good time constants for bacteria range from 5-10 milliseconds. Rapid decay indicates high salt concentration, causing arcing and cell death. Monitoring the time constant helps predict whether your transformation will succeed before observing colony growth.
Q5: How does electroporation compare to heat shock transformation?
Heat shock transformation uses calcium chloride and heat exposure instead of electrical pulses, making it gentler on bacteria and cheaper than electroporation. However, heat shock produces lower transformation efficiencies, takes longer, and works only on bacteria, yeast, and plant protoplasts. Electroporation achieves higher efficiency and applies to mammalian cells through a process called transfection.
Q6: What steps follow electroporation to identify successfully transformed bacteria?
After pulsing, add recovery media to cells and incubate at 37°C for one hour with shaking. Plate cells on antibiotic-containing agar and incubate overnight at 37°C. Only bacteria that successfully took up the plasmid survive the antibiotic. Count resulting colonies and calculate transformation efficiency by dividing successful transformants by total DNA plated.
Q7: What are the applications of electroporation beyond bacterial transformation?
Electroporation applies to mammalian cells through transfection, using lower field strengths and higher time constants than bacterial cells. Scientists also use electroporation in whole organisms like developing chicken embryos by injecting plasmid DNA into brain tissue and applying an electric field. This allows observation of fluorescent protein expression and structural changes in developing neural tissue.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:47
The Plasmid
2:17
Electroporation Basic Principles
3:26
Electroporating Bacteria
7:07
Preparing Electrocompetent Cells
9:36
Applications
11:43
Summary