عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا الكبد البشرية باستخدام إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق قنية الأوعية الدموية أولا في قطعة من الكبد باستخدام قنية الري. يتبع ذلك نضح وهضم قطعة الكبد باستخدام الكولاجيناز.

الخطوة الثالثة هي إزالة الكبسولة اللامعة ، والتي تطلق خلايا الكبد المنفصلة. الخطوة الأخيرة هي الطرد المركزي منخفض السرعة الذي يعزل خلايا الكبد. في النهاية ، يمكن التعرف على خلايا الكبد من خلال الفحص المجهري لتباين الطور أو عن طريق تلطيخ الألبومين باستخدام كيمياء السيتو المناعية مع تحديد قابلية وإنتاجية خلايا الكبد باستخدام مقايسة استبعاد الزرقاء الزرقاء.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات القنية والهضم. وذلك لأن القنية تتطلب بعض البراعة وقد يكون من الصعب تحديد إكمال الهضم. بالنسبة للأشخاص الجدد في هذه التقنية ، فإن إثبات الإجراء سيكون ناتالي لون ، فنية من مختبري.

في هذا العرض التوضيحي ، سنستخدم قطعة من كبد المصباح بدلا من قطعة من إنسان ، وقم بإعداد معدات نضح قطعة الكبد على النحو التالي ، واضبط الحمام المائي على درجة حرارة مناسبة بحيث تكون المحاليل 37 درجة مئوية عندما تصل إلى الكبد. جزء. 41 درجة مئوية جيدة للحلول الأول والثاني والثالث ، ومع ذلك ، يجب أن يكون محلول المكثف الزجاجي المغلف أربعة عند 37 درجة مئوية لتقليل فقدان نشاط الكولاجيناز. قبل فترة وجيزة من تشغيل منظم الغاز بالنسبة لجهاز الأكسجين من أخصائي علم الأمراض ، احصل على قطعة كبد تحتوي بشكل مثالي على كبسولة لامعة في الغالب أو سليمة تماما ومكان واحد فقط للقطع السطحي.

هذه القطعة الكبدية الموجودة على قمع Buchner التي تحتوي على قرص مرشح مثقوب ، يجب الآن تحضير نظام التروية بالمحلول الأول باستخدام معدل تدفق منخفض يتم إدخال قنية الري المنحنية مع أطراف الزيتون في الأوعية الدموية الأكبر على السطح المقطوع لقطعة الكبد. عندما يتدفق الدم من الكبد ، تصبح الأنسجة أخف وزنا في المناطق ذات التروية الجيدة. يختلف عدد القنية المستخدمة باختلاف الأحجام من الكبد.

بشكل عام ، يجب استخدام أربعة إلى ثمانية قنية للكبد تتراوح من أقل من 20 جراما إلى أكثر من 80 جراما. حدد مقياس القنية للحصول على ملاءمة مريحة وآمنة. اترك الأوعية الدموية الأصغر مفتوحة حتى يتم تصريف المخزن المؤقت من الأنسجة.

الآن ، قم بزيادة معدل التدفق على المضخة التمعجية إلى ما بين 110 إلى 460 مل في الدقيقة. إنه نضح جيد إذا كانت قطعة الكبد ذات لون أفتح طوال معدل التدفق المستخدم. يعتمد على حجم الكبد مع معدلات نضح أعلى تستخدم للكبد الأكبر.

بشكل عام ، يعد متوسط سرعة التروية 44 مل في الدقيقة لكل قنية مثاليا عبر مجموعة من أوزان الكبد المختلفة. يجب أن يؤدي معدل التدفق المختار إلى امتلاء طفيف في قطعة الكبد. حافظ على رطوبة قطعة الكبد أثناء التروية عن طريق تغطيتها بقطعة من الشاش مبللة بالمحلول الملحي.

بعد حشو الأنسجة بلتر واحد من المحلول ، قم بإخراج أي دم متبقي في قطعة الكبد. قم بتغيير سائل التروية إلى محلول اثنين وقم بتقطيعه لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتبديل سائل التروية إلى المحلول الثالث وقم بتقطيعه بنصف لتر.

الآن قم بتغيير سائل التروية إلى المحلول الرابع الذي يحتوي على الكولاجيناز. قم بإجراء هذا التروية بطريقة إعادة التدوير لمدة تسع إلى 12 دقيقة أو حتى يتم هضم الكبد بشكل كاف. يجب أن يبدو أن أنسجة الكبد تتفكك قليلا تحت الكبسولة اللامعة.

يجب أن يشعر الكبد أيضا بالنعومة عند فحصه بالجانب الحاد من المشرط. من المهم هضم قطعة الكبد لمقدار الوقت الصحيح لأن الهضم المفرط يمكن أن يؤدي إلى انخفاض قابلية خلايا الكبد للبقاء ويمكن أن يؤدي الهضم الخفيف إلى انخفاض إنتاجية خلايا الكبد. ابدأ بإيقاف تشغيل المضخة التمعجية وإزالة القنية من قطعة الكبد.

ثم ضع الأنسجة في طبق متبلور يحتوي على 100 إلى 200 مل من المحلول. خمسة. قم بإزالة الكبسولة اللامعة بعناية وتخلص من الخلايا برفق. إذا كانت هناك مناطق غير منتشرة جيدا ، فيمكن استخدام مشرط لقطع هذه المناطق لإطلاق الخلايا الموجودة بداخلها.

أضف المزيد من المحلول خمسة حسب الحاجة أثناء العملية ، وفي النهاية ارفع حجم المحلول من خمسة إلى 500 ملليلتر. الآن قم بتصفية تعليق الخلية مرتين. أولا ، قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة نايلون 210 ميكرون في قارورة مخروطية سعة لتر واحد.

ثم قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة نايلون 70 ميكرون في قارورة مخروطية سعة لتر واحد. صب حجمين متساويين من تعليق الخلية في أنابيب طرد مركزي سعة 200 مل. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المفلترة عند 72 جيجابايت لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

شفط snat وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في حوالي 200 مل من المحلول. خمسة. كرر الطرد المركزي وتعليق إعادة التركيب ثلاث مرات بعد الطرد المركزي النهائي ، وأعد تعليق الخلايا في محلول التخزين البارد للحصول على تركيز نهائي من اثنين إلى 5 ملايين خلية كبدية لكل مليلتر. يمكن استخدام مقايسة التريام الزرقاء لقياس عدد الخلايا بدقة باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

تظهر هنا خلايا كبدية ملطخة باللون الأزرق من 648 عزلة. كان متوسط صلاحية خلايا الكبد البشرية المعزولة 77 زائد أو ناقص 10٪ كان متوسط إنتاج خلايا الكبد 13 زائد أو ناقص 11 مليون خلية كبدية لكل جرام من الكبد عن طريق التألق المناعي. خلايا الكبد المعزولة التي تلطخت بشكل إيجابي للألبومين باللون الأخضر كان نقاوة 94 زائد أو ناقص 1٪ لتحديد نقاء خلايا الكبد.

تم إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي أربع مرات بخمس تكرارات لكل تجربة. يظهر الفحص المجهري لتباين الطور الخصائص المورفولوجية لخلايا الكبد مثل حجم خليتها الكبيرة وشكلها متعدد الأضلاع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا الكبد البشرية باستخدام إجراء تروية الكولاجيناز بخطوتين.