إنشاء نظام في المختبر لدراسة السلوك داخل الخلايا للمبيضات الجلابراتا في البلاعم THP-1 البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام نموذج للثقافة في المختبر لدراسة السلوك داخل الخلايا لمسببات الأمراض الفطرية البشرية الانتهازية. مختبر Canida ratta في الضامة المشتقة من خط الخلية البشرية أحادية الخلية TP واحد. لتحقيق هذا THP ، يتم التعامل مع الخلايا الوحيدة أولا بأربعة إستر لتمييزها إلى ضامة.

بعد ذلك ، تصاب البلاعم THP بخلايا canida GTA بعد ساعتين من الإصابة. تتم إزالة خلايا canida GTA غير البلعمية بواسطة غسالات PBS ويتم استرداد الخلايا الإلكترونية داخل الخلايا لمزيد من الدراسات بواسطة تناضح الضامة المصابة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم كل من الخلايا الفيروسية إلى خلايا canida GTA في البلاعم بالإضافة إلى نضوج Faiz Ross واستجابة السيتوكين في THP على FIDS الكلية عند عدوى المبيضات GTA.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لفحص مكتبة المبيضات المتحولة المتعاونة لملفات تعريف البقاء على قيد الحياة المتغيرة في البلاعم TSP one بطريقة شبه عالية الإنتاجية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه غير مكلف نسبيا ، وقابل للتكرار بدرجة كبيرة ، ويمكن تكييفه بسهولة مع الخلايا المناعية المختلفة وكذلك مسببات الأمراض الفطرية. لبدء الإجراء قبل يومين من الإصابة ، أحضر THP والخلايا أحادية الخلية إلى 80٪ من ثاني أكسيد الكربون في اليوم الأول ، وتخلص من مخاطر الثقافة وببطء ، برفق لإحضار جميع الخلايا الدقيقة إلى التعليق.

انقل معلق خلية وحيدة DHP إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي: تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق عند 1000 دورة في الدقيقة ، قم بتقطيع الوسيط في حاوية نفايات بمعدل خمسة مل قبل وسيط API في الأنبوب و reus. قم بتعليق حبيبات الخلية الواحدة THV عن طريق ماصة الوسط برفق ثلاث أربع مرات.

خذ 10 ميكرولتر من معلق الخلية لتحديد كثافة الخلية باستخدام مقياس الخلوي الدموي واضبط كثافة الخلية على 1 مليون خلية لكل مل. أضف ميكرولتر واحدا من محلول مخزون PMA 60 ميكرومولار إلى تعليق الخلية بحيث يكون التركيز النهائي 16 مولار واخلطه جيدا. قم بتوزيع معلق خلية مل واحد يتوافق مع 1 مليون خلية في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئر ونقلها إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 12 ساعة من الحضانة ، تخلص من الوسط القديم. أضف مل واحد من وسط RPI المسبق إلى كل بئر واحتضن الطبق لمدة 12 ساعة أخرى. سيتم استخدام هذه الخلايا للعدوى الإلزامية في كندا ، والتي سيتم عرضها لاحقا.

باستخدام الممارسات الميكروبيولوجية المناسبة ، قم بتلقيح مستعمرة EA واحدة في طبقة تحتوي على وسط ML YPD. احتضان الشاريرة لمدة 14 إلى 16 ساعة في حاضنة مثبتة على درجة حرارة 30 درجة مئوية بعد الحضانة بجهاز الطرد المركزي. ثقافة ML واحدة عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

تخلص من sup natin واغسل القشرة ثلاث مرات باستخدام PBS المعقم. بعد التخلص من مخزن الغسيل المؤقت ، قم بتعليق لوحة الخلايا في مل واحد من PBS معقم عن طريق سحب العينة اللطيف. بعد ذلك ، قم بقياس امتصاص معلق الخلية في مقياس ضوئي طيفي عند 600 نانومتر واضبط كثافة الخلية على 2 مليون خلية لكل مل باستخدام PBS.

خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية وقم بتخفيف مائة ضعف في لوحة انتشار PBS مائة ميكرولتر على وسط YPD AGA. احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية واحسب عدد المستعمرات التي ظهرت على لوحة YPD بعد يوم أو يومين ، اضرب هذا الرقم بعامل التخفيف المناسب لحساب وحدات تشكيل مستعمرة ساعة الصفر. سيتم استخدام هذه الوحدات العديدة المكونة للمستعمرات في كندا ريتا لإصابة DHE على البلاعم.

في الخطوة التالية ، أضف 50 لتر ماكرو من تعليق الخلية الكندية إلى طبقة أحادية البلاعم في صفيحة استزراع 24 حيت. قم بتربة اللوحة لتوزيع كل خلية بالتساوي واحتضانها عند 37 درجة مئوية بعد ساعتين من الحضانة. تخلص من الوسيط عن طريق قلب لوحة الثقافة في وعاء إلى كل بئر من لوحة الثقافة في مل تسلسلي PBS بعناية على طول جانب آبار البئر جيدا وتجاهل المخزن المؤقت.

كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. بعد ذلك باستثناء البئر الأول ، أضف وسيطا واحدا ML RPI إلى جميع الآبار الأخرى ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة التكاثر داخل الخلايا لخلايا المبيضات في 4 و 6 و 12 و 24 ساعة بعد الإصابة لاستعادة الخلايا الإلكترونية داخل الخلايا بعد ساعتين من عدوى البلاعم ، أضف مل من ماء الحبوب إلى الفوس. بعد دقيقتين ، اكشط البئر برفق باستخدام طرف واحد من البايبر لإزالة حطام البلاعم في البئر.

اشطف البئر واجمعه في أنبوب سمكة ماكرو سنتري. قم بإعداد تخفيف مائة ضعف من محللة خلية microFIT في PBS وقم بطلاء مائة ميكرولتر على وسط YPD AGA. احتضان الصفيحة عند 30 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين واحسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة.

اضرب هذا الرقم بعامل التخفيف المناسب لتعداد عدد خلايا التي تكون البلعمة بواسطة T اثنين والضامة بعد ساعتين من العدوى. وبالمثل ، يمكن تحديد عدد خلايا canida ator داخل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. يمكن تمثيل ما بعد العدوى والتكاثر داخل الخلايا كزيادة في 24 ساعة مقارنة ب CFUs الداخلية في ساعتين موضحة هنا.

نتائج أخرى لتجربة نموذجية حيث يبلغ العدد الإجمالي لخلايا تمساح كانيدا المصابة بجهاز البلاعم التلفزيوني ستة أضعاف 10 ، اثنان لكل أربعة. عدد الخلايا التي تم استردادها في ساعتين هو 3.7 ، ستة أضعاف 10.4. مما يوضح أن الخلايا الإلكترونية يتم البلعمة بمعدل 62.66٪ خلال فترة الحضانة المشتركة لمدة 24 ساعة.

يمكن أن تتغير الخلايا بخلاف النسخ المتماثل بمقدار 5.2 أضعاف حيث زاد عدد الخلايا الإلكترونية داخل الخلايا من 3.76 في 10.4 إلى 1.96 في 10.5. في هذه التجربة ، يمكن أيضا تقييم النسخ المتماثل داخل الخلايا لخلايا canida TER باستخدام GFP الذي يعبر عن الخلايا E بينما المجهر متحد البؤر لهذا الغرض. قم بإعداد وإصابة THV والضامة في شريحة من أربع غرف باستخدام البروتوكول الموضح سابقا للوحة زراعة 24 بئر.

بعد ساعتين من الإصابة. تخلص من الوسيط عن طريق قلب الشريحة في حاوية نفايات عند 500 ميكرولتر PBS لكل غرفة من الشريحة. اشطفها جيدا وتخلص من PBS.

كرر هذه الخطوة مرتين أخريين عند 500 ميكرولتر بارتفاع رسمي 3.7٪ لإصلاح الخلايا. احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة وتخلص من الارتفاع الرسمي. اغسل كل سعر بئر ب 500 ميكرولتر PBS لتعبئة البلاعم عند 500 ميكرولتر تريتون X بعد خمس دقائق من الحضانة ، وقم بإزالة Triton X اغسل البئر باستخدام PBS.

بتفكيك شريحة الغرفة بعناية باستخدام إزالة الغرفة وشريحة متسابق الهواء. ضع قطرة واحدة من وسيط تركيب Vector Shield الذي يحتوي على DPI على كل قطاع من حامل الشريحة ، وانزلاق غطاء ، وأغلق الحواف بخلايا مرئية لطلاء الأظافر تحت مجهر متحد البؤر. تظهر هنا الصور التمثيلية متحدة البؤر للبلاعم TP one المصابة ب GFE التي تعبر عن خلايا مختبر كانيدا من النوع البري ، وتشير حوالي ستة أضعاف في عدد الخلايا الإلكترونية داخل الخلايا من ساعتين إلى 24 ساعة على النسخ المتماثل المختبري للكانيدا في TP ، ويستخدم نهج الطفرات على نطاق واسع لتحديد عوامل البلاعم في مسببات الأمراض الميكروبية حيث يتم فحص عدد كبير من الطفرات في وقت واحد بحثا عن عيوب النمو عبر قليل النوكليوتيد الفريد علامة التسلسل.

نصف هنا البروتوكول الخاص بنا لشاشة STM لمكتبة كندا والمكتبة المتحولة ، والذي يتكون من ثلاث خطوات تالية. أول 96 بلازميد. يتم تثبيت كل منها يحتوي على كومة تسلسل قليلة النوكليوتيدات الفريدة على غشاء من النايلون.

في الخطوة الثانية ، يتم فحص مجموعة من 96 من طفرات CANIDA ator بحثا عن ملفات تعريف البقاء المتغيرة في البلاعم THV one ، تليها استعادة الخلايا المتحولة المتحولة الداخلية ل YPD ، والخلايا المتحولة المزروعة والبلاعم ، والتي سيشار إليها باسم عينات المدخلات والمخرجات على التوالي. أخيرا ، يتم تضخيم علامات توقيع الحمض النووي PCI وتسمية الراديو من عينات الحمض النووي الجينومية المدخلة والمخرجة. يتم تهجين منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى علامات فريدة ويتم قياس الإشارات المشعة على الغشاء وتحليلها.

لتجميع جهاز اللوحة 96 12 نقطة ، ضع غشاء نايلون مبلل فوق ورق شجرة الرياح الرطب وشد مسامير الوحدة. اغسل الغشاء بالماء المعقم ، متبوعا بغسول ب 0.4 مو هيدروكسيد الصوديوم. نقل 200 نانوجرام من محلول PLA BDNA من كتلة 96 12 إلى الآبار المقابلة لدم النقطة بعد غسل هيدروكسيد الصوديوم 0.4 مولار.

قم بإزالة الغشاء من جهاز الدم النقطي بعد وجود تخمير في اثنين من XXSC يعبر البلازما المنقولة BDNA إلى الغشاء في الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية. احتضان الغشاء في التهجين المسبق للهوائيات ، والمخزن المؤقت والمدخلات وزجاجات UNE لمدة ساعتين عند 42 درجة مئوية. قم بإعداد مجسات المستوى الراديوي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجيني المستخرج من لوحات خلايا الإدخال والإخراج والبادئات مقابل المنطقة المرافقة المقلوبة للعلامات الفريدة.

قم بتغيير طبيعة مجسات ملصق الراديو عند 99 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وقم بتقطيع الجل على الجليد. انقل مجسات de إلى زجاجات الإدخال والإخراج واحتضانها لمدة 14 إلى 16 ساعة عند 42 درجة مئوية. ما بعد التهجين.

اغسل أغشية الإدخال والإخراج كما هو موضح في البروتوكول. أخرج الأغشية من الزجاجات وجففها في الهواء وعرضها لشاشة صور فوسفو. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات ، امسح شاشة الفوسفور واحصل على الصور.

في هذا المثال ، يتم عرض مرشحين غشائيين مهجنين ، والذي يمثل فحص مجموعة واحدة من 96 طفرة كانيدا جاتوري للبقاء على قيد الحياة المتغير. في الخامس الأول ، كشفت البلاعم ، والقياس الكمي وتحديد نسبة شدة الإشارة لكل بقعة على الخرج إلى غشاء الإدخال ، أن أرقام العلامات 13 و 26 و 75 و 85 ممثلة تمثيلا ناقصا في المخرجات. هذه الأكوام محاطة باللون الأحمر وتعكس نمو أربعة طفرات مختلفة.

في المقابل ، يتم تمثيل الطفرات المكدسة ذات التسلسلات الفريدة 11 و 81 المميزة باللون الأخضر بشكل مفرط في عينة الإخراج. بمعنى آخر من هذه الشاشة ، يجب أن تزيد مجموعة من 96 متحولة من البقاء على قيد الحياة بينما تظهر أربعة طفرات عند النمو في الضامة. يجب التحقق من الأنماط الظاهرية المتغيرة للبقاء على قيد الحياة التي تم تحديدها في شاشة التجمع هذه في فحوصات العدوى الفردية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تفعيل النظام الفموي في المختبر لدراسة ملف النمو الداخلي لمسببات الأمراض الفطرية التي تهمك. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون قادرا على إجراء فحص حمام السباحة الطافرة على نطاق واسع باستخدام النظام الآن.