النهج الوراثية إلى الأمام في الكلاميديا ​​المتدثرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء التحليل الجيني على الكلاميديا تريتوس عن طريق إجراء الطفرات الكيميائية وتحديد ارتباطات النمط الظاهري للنمط الجيني. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد سلالات متحولة من الكلاميديا تراكوم أولا باستخدام الطفرات الكيميائية. بعد ذلك ، يتم تحديد جميع الطفرات المتولدة عن طريق تسلسل الجينوم الكامل ، متبوعا بتجميع الجينوم الموجه المرجعي.

ثم يتم تحديد ارتباطات النمط الجيني للنمط الظاهري في السلالات الطافرة. أخيرا ، يتم تأكيد ارتباطات النمط الجيني للنمط الظاهري عن طريق توليد سلالات مؤتلفة وتحليلها. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن طفرة في جين كلاميديا معين تؤدي إلى نمط ظاهري مثير للاهتمام من خلال مزيج من مناهج الطفرات الكيميائية الكلاسيكية والجيل التالي سينغ.

توجد حاليا طرق متاحة لاستبدال الجينات في الكلاميديا والأدوات الجينية الجزيئية لدراستها في مهدها. لا تتطلب هذه الطريقة التحول باستخدام الحمض النووي المؤتلف أو تطوير الأدوات الجينية الجزيئية ولكنها تحقق نفس الهدف. هذا هو تعيين الوظيفة لمنتجات الجينات الفردية.

لتحضير الخلايا المستنبتة ، قم بتثبيت ما يقرب من مرة واحدة في 10 من الخلايا الفيروسية الست لكل 25 سم مربعة في ثلاثة ملليلتر من DMEM مكملة ب 10٪ FBS تحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى الطلاقة بعد حوالي 24 ساعة ، استنشق الوسط وأصيب الخلايا بالكلاميديا في تعدد العدوى خمسة. في حجم إجمالي قدره ثلاثة ملليلتر من D-M-E-M-F-B-S يحتوي على 200 نانوغرام لكل مليلتر من السيكلوهيكسيميد لبدء الطفرات في 18 ساعة بعد الإصابة تحت غطاء كيميائي ، قم بإعداد 20 ملليغرام لكل مليلتر من سلفونات إيثيل ميثان أو EMS في PBS مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.

EMS هو مطفر قوي ومسرطن. لذلك ، راجع بروتوكول النص للتخلص منه. استنشق الوسط من خلايا Vero واغسلها مرة واحدة بثلاثة ملليلتر من PBS مع كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم.

ثم عند ثلاثة ملليلتر من محلول EMS واحتضانه لمدة ساعة واحدة في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة EMS ووضعه في وعاء به هيدروكسيد الصوديوم المولي لتعطيل المطفرة قبل غسل الخلايا ثلاث مرات لإزالة أي متبقي EMS. ثم عند ستة ملليلتر من DMEM، 10٪ FBS مع 200 نانوغرام لكل مليلتر من سيكلو هايد و25 ميكروغرام لكل ملليلتر من جنتاميسين وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة.

تظهر الشوائب خالية من البكتيريا بعد حوالي 36 ساعة من الطفرات في 72 ساعة. تمتلئ حوالي 10٪ من الشوائب بالبكتيريا بينما يظل الباقي فارغا لاستخراج الأجسام الأولية أو EBS عن طريق التحلل المنخفض التوتر ، شفط الوسط تماما. أضف ملليلترا واحدا من الماء والصخور لمدة 10 دقائق لإخراج الخلايا ، وقم بتقطيع الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل.

بعد جمع المحللة في أنبوب فوج دقيق ، أضف 0.25 مل من خمسة × السكروز ، أو محلول الغلوتامات الفوسفاتية ، أو SPG إلى تركيز نهائي واحد × وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بتعيين طبقات أحادية متجانسة من خلايا ves في ست ألواح بئر عن طريق بذر حوالي 0.4 مرة 10 من الخلايا الست في ثلاثة ملليلتر من DMEM 10٪ FBS لكل بئر تسمح للخلايا بتكوين طبقة أحادية متجانسة خلال ال 24 ساعة القادمة. الخريف المقبل على الجليد ، محلول مخزون من الكلاميديا المطفرة.

ثم قم بإعداد ستة أنابيب من التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف بحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر لكل تخفيف في DMEM 10٪ FBS ، ووضعها على الجليد. استخدم ثلاثة ملليلتر لكل بئر من PBS لغسل خلايا Vero مرتين. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من DMEM إلى كل بئر لستة ألواح بئر و 100 ميكرولتر من التخفيف البكتيري في نسختين.

حرك الطبق لضمان خليط متساو. قم بتدوير الصفائح المصابة عند 2،700 GS لمدة 30 دقيقة عند 15 درجة مئوية. ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ساعتين.

في غضون ذلك ، قم بإعداد 0.54٪ AROS في DMEM عن طريق الجمع بين المكونات التالية والخلط أولا. حسنا ، ثم اخلطي 18.9 مل من المعقمة الساخنة ، 1.2٪ في الماء مع التحريك لمنع التكتلات. احفظ الخليط دافئا في حمام مائي 55 درجة مئوية.

استنشق المعلق البكتيري من الأطباق وأضف ستة ملليلتر من محلول aro الدافئ. اتركه يتماسك تماما في درجة حرارة الغرفة خارج غطاء المحرك. ثم في غطاء السلامة الحيوية مع إزالة الأغطية ، جفف الأطباق لمدة 15 دقيقة إضافية عندما تجف الألواح ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة إلى 10 أيام.

يجب أن تكون اللويحات مرئية بمساعدة مجهر تشريح قبل يوم واحد من عزل الطفر. انظر واحدا في 10 إلى الخلايا الصفرية الأربع في 100 ميكرولتر لكل بئر. في صفيحة 96 بئر ، ستتلاقى الخلايا في غضون 24 ساعة.

تحت مجهر التشريح ، ضع علامة على اللويحات المراد قطفها ثم استخدم ماصة حاجز معقمة سعة مليلتر واحد لجمع سدادات اللويحات. يقوم Resus بتعليق اللويحات في 100 ميكرولتر من DMEM مع 10٪ FBS 400 نانوغرام لكل مليلتر ، وسيكلو ، وهايد ، و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر. الجنتاميسين لتوسيع السلالات الطافرة ، تراكب التعليق على طبقات أحادية متقاربة من خلايا فيرو.

قم بتدوير الصفائح عند 2 ، 700 GS و 15 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل احتضان ديسيبل الحصاد عندما يصاب أكثر من 50٪ من الخلايا ، والذي يمكن أن يحدث في وقت مبكر يصل إلى 48 ساعة بعد الإصابة وحتى 14 يوما. تسمح هذه الكمية من الخلايا المصابة بتخزين ما يكفي من البكتيريا القابلة للحياة لاستخراج المركبات الكهربائية عن طريق التحلل المنخفض التوتر للخلايا المصابة. بعد شفط الوسط عند 160 ميكرولتر من الماء المعقم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

استخدم أطراف الحاجز لتعطيل الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان التحلل الكامل. أخيرا ، انقل 160 ميكرولترا من كل محللة إلى أنابيب fuge دقيقة. أضف 40 ميكرولترا من خمسة XSPG وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لفحص الطفرات وفحصها بحثا عن الأنماط الظاهرية ذات الأهمية.

التعرض للطفرات إلى شوائب تبدو خالية من البكتيريا بسبب موت الخلايا البكتيرية على الأرجح. عادة ما يقوم المصل LGVL 2 بقمل الخلايا المصابة تماما في غضون 48 ساعة بعد الإصابة ، ولكن العلاج بالمطفرات يمكن أن يمتد هذه الدورة إلى أكثر من 90 ساعة ، ومن المتوقع أن يتعافى حوالي 10٪ من الشوائب في تجاربنا. أدت خلايا Vero المصابة المعالجة ب 20 ملليغرام لكل مليلتر من EMS إلى انخفاض بنسبة 99٪ في تعافي النسل المعدي مقارنة بالضوابط غير المعالجة كما هو موضح في هذا الشكل.

أدى علاج الطفرات أيضا إلى ظهور لويحات ذات أشكال متغيرة ، بما في ذلك لويحات صغيرة. تشمل الأشكال الأخرى لويحات تظهر حبيبية أو متكتلة أو على شكل قرص العسل كما هو موضح هنا. يمكن أن تؤدي جرعات EMS المستخدمة في هذه الدراسات إلى ما بين ثلاث إلى 30 طفرة لكل جينوم KCL كما تم تقييمه تجريبيا بواسطة NGS.

على الرغم من أن EBS المنقى المتدرج خال إلى حد كبير من مادة الخلية المضيفة ، إلا أنه تم اكتشاف الحمض النووي للمضيف ويضم حوالي 10 إلى 15٪ من الاستعدادات الجينومية باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء فحوصات للأنماط الظاهرية مثل ضعف التكاثر المتماثل في خلايا زراعة الأنسجة أو فقدان الأنشطة الكيميائية الحيوية أو تغيير الأشكال البكتيرية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العوامل البكتيرية المطلوبة لتكوين والحفاظ على الكلاميديا والعوامل المسببة للأمراض.