تصور الآثار المترتبة على تجربة إيجابية في وقت مبكر، اللمس تحفيز، على مورفولوجيا شجيري ومتشابك الربط مع جولجي كوكس تلطيخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تقنيات تلطيخ الذهب G Cox لتصور التغيرات المورفولوجية في الخلايا العصبية التي تتبع التحفيز اللمسي في وقت مبكر من الحياة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعطاء التحفيز اللمسي ثلاث مرات يوميا من اليوم الثالث بعد الولادة إلى اليوم 21 بعد الولادة. الخطوة الثانية هي تذوق بمجرد بلوغها سن الاستفسار وتخزين أدمغتها في محلول Goldy cos.

بعد ذلك ، يتم تقطيع الأدمغة باستخدام Aome. الخطوة الأخيرة هي تشريب الأدمغة بتقنية التلوين المشترك GOGI. في النهاية ، يتم استخدام الإجراء المشترك GOGI لتصور الخلايا العصبية الفردية ، مما يسمح بتحليل التغيرات المورفولوجية.

يكمن جمال تقنية Goy Cox في أنها تسمح لنا بتحديد بنية الخلايا العصبية وربطها بالنتائج السلوكية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى اضطرابات النمو حيث ثبت أن التحفيز اللمسي فعال في كل من التعافي السلوكي والتشريحي من هذه الاضطرابات. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التشريح العصبي للفئران ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية النموذجية الأخرى وأنسجة المخ البشري.

لمساعدتنا على زيادة فهمنا للدونة المعتمدة من ذوي الخبرة ، يتم الحفاظ على في دورة مظلمة فاتحة مدتها 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء بعد الولادة. يتم إيواء كل أنثى فأر على حدة مع نسلها. لتجنب الضغط الإضافي المتعلق بالمناولة ، تتلقى الجراء تحفيزا عن طريق اللمس بدءا من P ثلاثة.

بعد وزن الجراء قبل جلسة التحفيز اللمسي الصباحية ، انقل الجراء في أقفاص منازلهم إلى غرفة اختبار منفصلة. ضع قفص المنزل على وسادة تدفئة مضبوطة على 24 درجة مئوية. عندما تكون جاهزا للتحفيز اللمسي ، قم بإزالة السدود من قفص منزلهم وضعها في قفص مؤقت مع الطعام والماء.

احتفظ بالسد والقفص المؤقت في غرفة التكاثر. بعد ذلك ، استخدم لوحا صلبا لتقسيم قفص المنزل إلى نصفين. ثم قم بتعيين نصف الجراء بشكل عشوائي من كل فضلات للخضوع للتحفيز اللمسي مع النصف الآخر كعناصر تحكم.

ضع علامة على أرجلهم الخلفية وذيلهم بعلامة دائمة للتمييز بين المجموعات ووضع الجراء في مجموعة التحفيز اللمسي في جانب واحد من القفص والسيطرة على الجراء في الجانب الآخر. اضبط المؤقت على 15 دقيقة باستخدام ريشة ناعمة مثل منفضة الغبار قم بتنظيف جميع الجراء في مجموعة التحفيز اللمسي في نفس الوقت لمدة 15 دقيقة متتالية.

عادة ما تتجمع صغار الفئران معا ويبدو أنها تدخل في دورة نوم عميقة ، مما يجعل من السهل جدا تحفيز جميع الجراء مرة واحدة. مع تقدم الجراء في العمر ، يصبحون أكثر نشاطا مع بعض الجراء الذين يمشيون ويحققون. أثناء الجلسة ، انقل أي صغار متجولة إلى المجموعة للتأكد من أن كل جرو يتلقى تحفيزا متساويا.

بعد 15 دقيقة من التحفيز اللمسي ، أعد الأم إلى القفص وانقل القفص مرة أخرى إلى غرفة التكاثر. تتكرر هذه العملية ثلاث مرات في اليوم. لمدة 19 يوما بعد جلسة التحفيز اللمسي الأخيرة ، فطام الجراء عن أمهاتهم ، يتم إيواء الجراء في أقفاص مع خمسة أو ستة أخرى مفطومة من نفس الجنس ، وتترك الفئران دون إزعاج في ظل ظروف السكن القياسية حتى تصل إلى سن الاستفسار.

يتم جمع العينات عندما يصل عمر إلى 100 يوم. بعد القتل الرحيم والتروية داخل القلب ، يتم استخراج الدماغ. الحرص على الحفاظ على المخيخ سليما.

ضع الأدمغة في زجاجة Nalgene غير شفافة مملوءة ب 20 مل من محلول Goldy Cox حيث يتم الاحتفاظ بها لمدة 14 يوما. بعد 14 يوما ، استبدل المحلول بمحلول سكروز بنسبة 30٪. احتفظ بالأدمغة في محلول السكروز لمدة يومين إلى خمسة أيام قبل التقسيم للتقسيم.

جفف الدماغ قبل التثبيت على مرحلة التقسيم باستخدام غراء الأكريليك سانو لمنع التمزق أو التقسيم غير المتكافئ ، وتأكد من أن الدماغ بأكمله مؤمن بإحكام على المسرح. بعد ذلك ، املأ خزان Vibram بمحلول السكروز بنسبة 6٪ حتى يغطي شفرة التقسيم. اضبط سرعة وسعة Vibram على خمسة.

قم بتقطيع الدماغ إلى أقسام 200 ميكرون وضع الأقسام على شريحة مجهر جيلاتين بنسبة 2٪. تأكد من إبقاء الأقسام رطبة أثناء التقسيم عند جمع جميع الأقسام ذات الأهمية. اضغط على الأقسام على الشرائح عن طريق الضغط بورق مبلل.

ضع الشرائح في رف منزلق وقم بتخزينها في غرفة رطوبة لمدة 12 ساعة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من أربعة أيام. لبدء إجراء التلوين ، قم بتسمية وإعداد 12 طبقا من ألواح تلطيخ الزجاج. أولا ، اغمر الشرائح في الماء المقطر لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، ضع الشرائح في هيدروكسيد الأمونيوم واحتفظ بها في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد دقيقة إضافية في الماء المقطر ، ضع الشرائح في Kodak Fix لمدة 30 دقيقة مع حماية من الضوء. ضع الشرائح في الماء المقطر مرة أخرى قبل التجفيف في سلسلة من محاليل الكحول المتدرجة.

بعد آخر غسل بالكحول ، ضع الشرائح في محلول ثالث لمدة 15 دقيقة. أخيرا ، ضع الشرائح في hemo D لمدة 15 دقيقة. عندما تكون جاهزا ، استخدم الأهمية القصوى لوضع زلات الغطاء على الشرائح والسماح للشرائح بالجفاف في الهواء قبل فحصها بالمجهر المرئي.

فيما يلي صورة تمثيلية لخلية عصبية شبه معدنية ملطخة ب Golgi Cox في فأر تلقى تحفيزا عن طريق اللمس أثناء التطور. تظهر صورة مكبرة أشواك شجيرية على التشعبات الطرفية. الصورة الأخف على اليسار هي من فأر في المجموعة الضابطة والصورة الداكنة من فأر تلقى التحفيز اللمسي.

يمثل هذا الرسم البياني متوسط التعقيد الشجيري القمي والبازلي للخلايا العصبية في منطقة CG الثلاثة من الفئران البالغة التي تلقت تحفيزا لمسيا أثناء التطور أو لم تتلقا. باتباع هذا الإجراء، لدينا ميزة أنه إذا أردنا طرح أسئلة إضافية، فقد قمنا بتلطيخ الدماغ بأكمله وبالتالي يمكننا العودة واستخدام نفس أنسجة المخ للإجابة على هذه الأسئلة. من خلال تطوير هذه التقنيات ، مهدنا الطريق للباحثين لاستكشاف فائدة التحفيز اللمسي كعلاج لعلاج صدمات الرأس أو غيرها من أشكال الإصابات العصبية بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق لباحثي علم الأعصاب لاستكشاف إمكاناتها في علاج صدمات الدماغ واضطرابات النمو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تزويد الجراء الملفوفة بتجربة ثرية للتحفيز اللمسي بالإضافة إلى وسيلة لتصور الخلايا العصبية والمشابك الفردية.