تحديد القائمة على ميكروأري من الفردية هيرفي الامكنه التعبير: التطبيق على العلامات البيولوجية ديسكفري في سرطان البروستاتا

يحدد هذا التحليل النسخي لأنسجة سرطان البروستاتا البشرية مواقع التعبير عن الفيروسات القهقرية البشرية الفردية لتقييم مصفوفة دقيقة مخصصة عالية الكثافة كأداة فحص لاكتشاف المؤشرات الحيوية. بعد أن يقوم الجراح بإزالة عضو البروستاتا من المريض ، يقوم أخصائي علم الأمراض بإعداد الأنسجة السرطانية الورمية والمجاورة بشكل منفصل في مستخلص المختبر ، وتنقية وتأهيل MR. تعمل NA من الأنسجة الطبيعية والسرطانية على تضخيم mRNAs باستخدام مجموعة تصفيق النسخ الكاملة ثم تشق وتسمية المنتجات المضخمة الناتجة. ثم قم بمعالجة المصفوفين الدقيقين H-E-R-V-V بالتتابع عن طريق ملء التهجين والغسيل والمسح الضوئي.

في نهاية المطاف ، باستخدام مجموعات مسبار طرق الحوسبة الحيوية ، يمكن تتبع إشارة كبيرة وتعبير تفاضلي مما يؤدي إلى تحديد المواقع الفردية النشطة النسخية. منذ سنوات عديدة استكشفنا سلوك عائلة IRV W في سياقات مختلفة, بما في ذلك عينات التصلب المتعدد. المشيمة الخصية.

كانت لدي لأول مرة فكرة عن طريقتها عندما بدأنا في فهم أن المجموعات الفرعية المتداخلة أو غير المتداخلة من عناصر IRV داخل الأسرة تم التعبير عنها. حسب السياق. يسمح استخدام تكنولوجيا السفن بالاستكشاف المنسق للعديد من عائلاتها والتحليل المتزامن لمناطق مختلفة لكل موضع.

على سبيل المثال ، US three و UF المجال ل LTR ، والذي قد يدعم دورا مباشرا في علم الأمراض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السرطان ، مثل تشخيص سرطان البروستاتا ، حيث تفتقر المؤشرات الحيوية للبروتين الموجودة مثل PSA إلى الخصوصية والحساسية. وفي الوقت نفسه ، يبدو الحمض النووي الريبي غير المشفر مثل PCA three واعدة أكثر ، مما يدل على إجراء التعامل مع البروستاتا سيبيع ميشيل فني من قسم علم الأمراض.

سيوضح فيليب بير إعداد وتحليل هدف استخراج الحمض النووي الريبي بينما سيوضح فني من مختبر جون يونيت إجراء السفينة. قم بتركيب مسار الأنسجة المجمدة عموديا على كومة صغيرة من OCT في ناظم البرد. خذ قسما واحدا بخمسة ميكرون ، وقم بلطخه ب Blu udine ، ثم قم بإجراء فحص نسيجي سريع لفحص طبيعة الأنسجة للأنسجة السرطانية.

قم بتقدير كمية الخلايا التورالية وحدد فقط النوى التي تحتوي على أكثر من 80٪ من الخلايا السرطانية. قطع قسم آخر من خمسة ميكرون وصمة عار بالهيماتين والإيوين والزعفران. الآن قم بقص 15 قسما بسماكة 30 ميكرون ونقلها إلى أنبوب orph خال من الحمض النووي الريبي.

ثم خذ قسما أخير خمسة ميكرون للتلوين بالهيماتين والإيوين والزعفران للتحكم في كمية الخلايا السرطانية. في نهاية الإجراء ، قم بنقل العينات على الجليد الجاف إلى مختبر البيولوجيا الجزيئية. قم بتجانس الأنسجة في محلول Triol على الثلج باستخدام مطحنة محمولة حتى يذوب النسيج تماما.

احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم أضف 300 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة لمدة 15 ثانية. بعد دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، جهاز طرد مركزي عند 12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية.

بالنسبة للحمض النووي الريبي ، انقل المرحلة المائية العلوية بعناية إلى أنبوب جديد. أضف 750 ميكرولتر من الأيزوبروبانول ، واخلطها عن طريق الانعكاس واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي للعينات لحبيبات الحمض النووي الريبي المترسب ، اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي بملليلتر واحد من 80٪ الإيثانول.

ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 7 ، 500 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام أطراف P 1000 و P 10. اترك الإيثانول المتبقي يجف في الهواء.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي. انقل العينات إلى كتلة حرارية 70 درجة مئوية. لإذابة الحبيبات ، تحقق من جودة الحمض النووي الريبي وسلامة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي و NanoDrop وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

في استخراج الحمض النووي الريبي المثالي ، يكون رقم سلامة الحمض النووي الريبي عادة سبعة أو أكثر. استمر في تصفيق النسخ بالكامل ، ومجموعة تضخيم الحمض النووي الريبي باتباع التعليمات من المورد. ثم قم بتنقية منتج CD NA المفرد الذي تقطعت به السبل.

تحقق من العائد وتوزيع الحجم ل CDNA أحادي السبل باستخدام محلل حيوي و NanoDrop وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب أن يتراوح توزيع حجم CD NA المضخم عادة بين 101 ، 500 قاعدة مع ذروة حوالي 600 قاعدة ولها توزيع عام على شكل جرس. بجانب تجزئة CDNA ، أضف 6.6 ميكرولتر من مزيج التجزئة إلى ميكروغرامين من CD NA في 30 ميكرولترا يدور ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم قم بتعطيل الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واستمر في وضع الجليد. Aliquot ميكرولتر واحد من CDNA المجزأ للتحقق من توزيع الحجم المستند إلى Agilent. يعمل العلاج الوحيد للحمض النووي على تجانس توزيع حجم CD NA إلى حوالي 100 نيوكليوتيد قبل التهجين.

تحقق من توزيع حجم CD NA الفردي الذي تقطعت به السبل باستخدام محلل حيوي Pfizer مبللة مسبقا. شريحة الجينات HERV مع 200 ميكرولتر من التهجين المسبق. تخلط وتحتضن عند 50 درجة مئوية ، 60 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

أضف 131 ميكرولترا من مزيج التهجين إلى 69 ميكرولترا من CD NA المجزأ والملصق في مزيج درجة حرارة الغرفة وفي الطبيعة لمدة دقيقتين عند 95 درجة مئوية. ثم احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق. الآن قم بإفراغ شريحة الجينات HERV المبللة مسبقا وقم بتحميل المستحضر المستهدف 200 ميكرولتر.

ضع بقعا صلبة على هجينة SEPTA عند 50 درجة مئوية ، 60 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة. أفرغ شريحة جين HERV واملأ المسبار. كن مصفوفة مع 250 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت ، ومكان 600 ميكرولتر من مزيج محلول SAPE و 600 ميكرولتر من مزيج محلول الأجسام المضادة في الموضعين رقم واحد والثاني ، ضع 800 ميكرولتر من المصفوفة التي تحمل المخزن المؤقت في الموضع.

رقم ثلاثة ، ادفع الإبر لأسفل. قم بتعيين الشريحة المناسبة لكل وحدة. حدد بروتوكول FS 4 5 0 0 0 4 وقم بتشغيل كل وحدة نمطية وفقا لتعليمات البرنامج.

ضع بقعا صلبة على الحاجز لمنع التسرب. ثم قم بتحميل الشريحة في اللودر التلقائي أو بدلا من ذلك مباشرة في الماسح الضوئي. ابدأ المسح.

بعد مسح ملفات CEL النقطية للرقاقة ، تحقق من الصورة وقم بمحاذاة الشبكة مع المكان لتحديد خلايا المسبار. أيضا إخضاع الرقائق لعدة قياسات لمراقبة الجودة. الآن تطبيع الرقائق وتطبيق نهج التجميع الهرمي لاستكشاف مجموعة البيانات بعد التطبيع ، تم إجراء تحليل كبير للبحث عن الجينات المعبر عنها تفاضليا من إجراء المصفوفة الدقيقة وتبعه تصحيح معدل اكتشاف خاطئ على خمس عينات من الورم الزوجي المطابق والحمض النووي الريبي الطبيعي للبروستاتا.

أدى ذلك إلى تحديد 207 مجموعة مسبار HERV بقيم تعبير تفاضلية. حدد التحليل الإضافي ل 35 عينة إضافية من الأنسجة السرطانية الأخرى 44 مجموعة مسبار HERV خاصة بالبروستاتا. هذه هي أكثر 10 هياكل HERV ذات صلة.

أخيرا ، يمكن إجراء التحليل الوظيفي في واجهة مخصصة تتكون من تسلسلات مشروحة ذات أهمية موضحة بعنصر واحد H-E-R-V-W تم اختياره في أفضل 10 هياكل مستقبلية للفيروسات تم تحديدها ومصنفة في الأعلى مع مجساتها المحددة المخصصة الموجودة في مصفوفين H-E-R-V-V والمسماة بمناطق الفيروسات القهقرية الوظيفية LTR gag POLE N ، ومع التركيز على المجالات الفرعية الخمسة الأولية LTRU ثلاثة و U الخمسة ، والتصميم اللاحق لبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من صحة RT PCR. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إتقان الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها إعداد العينة والهدف ، وهي متطلبات أساسية للجودة للنجاح في استخدام الأشعة الدقيقة للأرض ، بالإضافة إلى اكتشاف العلامات الحيوية التقليدية. لقد صممنا مصفوفة دقيقة عالية الكثافة بتنسيق أميتري ، بهدف توصيف تعبير الفردات على النحو الأمثل من أجل فهم أفضل لما إذا كان يمكن أن يكون نشطا إذا كان النسخ NA للمنطقة الجافة غير المخادعة أو تعديل التعبير الجيني للترميز.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض المزمنة والمعدية لأن التحديد المنهجي للأصوات النشطة قد يوحد الفرضية الجينية والفيروسية والبيئية كعوامل محفزة في الأمراض المختلفة. قد يكون العمل مع عدد محدود من العينات في تجربة إثبات المفهوم الفنية أمرا صعبا لاكتشاف المؤشرات الحيوية بنجاح لاتخاذ الاحتياطات ، مثل احترام سير العمل الذي تم التحقق من صحته إحصائيا ، بما في ذلك متانة الطريقة ، وأخذ عينات تمثيلية من المرضى المستهدفين.