عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل أنابيب الخلايا البطانية من الشريان الشرسوفي العلوي للفأر أو SEA لدراسة ديناميكيات الإشارات داخل الخلايا وبين الخلايا لبطانة الأوعية الدموية الدقيقة السليمة الأصلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل SEA أولا عن جدار العضلات والهيكل العظمي للفأر. في الخطوة الثانية ، يتم هضم الوعاء بلطف وسموماتيا ، ثم يتم هضمه بعناية لفصل خلايا العضلات الملساء والهجوم الليفي عن أنبوب الخلية البطانية.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تأمين الأنبوب في غرفة تدفق ويتم دمجها بشكل فائق بمحلول ملحي فسيولوجي. في النهاية ، يمكن استخدام التصوير متحد البؤر لتصور إشارات الكالسيوم في الأنبوب البطاني الوعائي الدقيق الأصلي السليم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل زراعة الخلايا البطانية ، هي أن الخلايا البطانية التي تتكون منها الأنبوب وتحافظ على مورفولوجيتها الأصلية ، وتعبير البروتين ، واستجابتها ، البطانة جزء لا يتجزأ من التحكم في تدفق الدم في جميع أنحاء الجسم.

لنا تطبيق هذه التقنية بالتحقيق في أحداث إشارات الخلية إلى الخلية التي تتوسط التحكم في تدفق الدم وكيف يمكن أن تنحرف أثناء الخلل الوظيفي في الأوعية الدموية. لعزل SEA أولا ، قم بعمل شق صغير عبر الجلد فوق منطقة العانة مباشرة للفأر المخدر ، وقم بتمديد الشق بشكل جانبي في كل اتجاه إلى الأطراف الخلفية المعنية ، ثم استمر في الشق على طول خط الوسط البطني إلى الجزء العلوي من القفص الصدري ، مع تمديد الشق بشكل جانبي في كل اتجاه إلى الأطراف الأربعة المعنية. الآن ارفع الجلد برفق واقطع النسيج الضام الذي يربط الجلد بالعضلة الأساسية ، مما يؤدي إلى تعريض سطح عضلات البطن بالكامل.

ري العضلات المكشوفة بمحلول ملحي بدرجة حرارة الغرفة. ثم تحت مجهر ستيريو ، ارفع وسادة الدهون الموجودة في الجزء السفلي من القص. قم بعمل شق من خلال وسادة الدهون وعلى طول الضلع السفلي.

يجب أن يكون SEA مرئيا الآن ، مع الحرص على عدم إتلاف الشريان ، وري الأنسجة المكشوفة بدرجة حرارة أكبر للغرفة ، ومحلول ملحي. بعد سحب الطبقة العليا من العضلات الهيكلية ، لاحظ طول SEA ثم استئصال طبقة العضلات الرقيقة تحت الشريان بعناية. بعد ذلك ، استخدم ملقطا بزاوية لتمرير خياطة حريرية بطول ستة أوه أسفل SCA.

ثم اربط الشريان والوريد المجاور له لإبقائه مضغوطا وللحفاظ على احتفاظ الدم داخل تجويف الوعاء الدموي. بعد ربط SCA على الجانب المقابل ، قم بعمل شق على طول خط الوسط لعضلات البطن لفصل الجانبين المعنيين ، ثم قم بتمديد الشق بشكل جانبي في كل اتجاه كما هو الحال بالنسبة للجلد. استمر في الشق عموديا على طول الحافة الخارجية لفصل عضلة البطن تماما عن الجسم.

ثم قم بقص SEA فوق الربط للحفاظ على الختم ووضع العضلات والشريان المعزول في دورق سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من أربع درجات مئوية المخزن المؤقت للتشريح. بعد عزل العضلات عن الجانب الآخر من البطن ، احتضان الأنسجة في مخزن مؤقت للتشريح لمدة 10 دقائق. الآن ، ضع عضلة البطن التي تحتوي على SEA في طبق بتري بدرجة أربع درجات مئوية مغطى بطبقة من واقي الأسطوانة ويحتوي على عازلة تشريح استخدم دبابيس حشرات 0.15 ملم لتمديد SEA والعضلات إلى أطوال تقريبية ملحوظة سابقا في الجسم الحي.

قم بتأمين SEA في حارس الأسطوانة الذي يوجه العضلات بحيث تكون الطبقة الرقيقة التي تواجه الصفاق في الأعلى. ثم العمل من موقع المنبع للربط باتجاه نهاية مجرى النهر ، قم بإزالة حوالي سنتيمتر إلى سنتيمترين من SEA من الوريد المزدوج والأنسجة المحيطة به حتى أول موقع فرعي رئيسي. قطع SEA فوق موقع الفرع مباشرة وأسفل الربط مباشرة.

بعد ذلك ، استخدم قطعة من الأنابيب المرنة لتوصيل الواجهة الخلفية للماصة بحقنة سعة خمسة ملليلتر تحتوي على مخزن مؤقت لتشريح الجليد. قم بتأمين طرف ماصة القنية داخل حجرة التشريح وقم بتسخين SEA. ثم بمجرد التخلص من جميع كريات الدم الحمراء ، قم بإزالة SEA من ماصة القنية وإزالة الماصة من طبق التشريح لعزل الأنابيب البطانية.

أولا ، املأ أنبوب زراعة زجاجي مقاس 12 × 75 ملم في منتصف الطريق بمحلول تشريح مثلج بارد. ثم بعد تقطيع SEA إلى قطع من واحد إلى ثلاثة ملليمترات ، استخدم ملقطا بزاوية لنقل القطع الشريانية إلى أنبوب الثقافة ووضع الأنبوب على الجليد. بعد ذلك ، اجمع بين إنزيمات الهضم مع المخزن المؤقت للتفكك إلى حجم نهائي قدره مليلتر واحد في أنبوب استزراع منفصل مقاس 12 × 75 ملم وقم بتسخين محلول الإنزيم مسبقا إلى 37 درجة مئوية باستخدام كتلة تسخين.

قم بإزالة أنبوب الثقافة الذي يحتوي على القطع الشريانية من أربع درجات مئوية وضعه في درجة حرارة الغرفة للتسخين أثناء ارتفاع درجة حرارة محلول الإنزيم إلى 37 درجة مئوية. استنشق بعناية المخزن المؤقت لتشريح درجة حرارة الغرفة الآن من أنبوب الاستزراع ، مع ترك حجم صغير يحتوي على أجزاء الوعاء. الآن أضف ببطء درجة حرارة الغرفة ، ومخزن مؤقت للتفكك بدون إنزيمات إلى أجزاء الأوعية الدموية بحيث تظل القطع الشريانية في الجزء السفلي من أنبوب الثقافة لغسل أي مخزن مؤقت متبقي.

بمجرد أن يصل محلول الإنزيم إلى 37 درجة مئوية ، قم بشفط المخزن المؤقت للتفكك من أنبوب الثقافة الذي يحتوي على أجزاء الأوعية الدموية مرة أخرى ، تاركا حجما صغيرا يحتوي على أجزاء الأوعية الدموية. الآن انقل محلول الإنزيم 37 درجة إلى أنبوب المزرعة واحتضان أنبوب المزرعة في كتلة التسخين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة ، قم بإعداد ماصة محشوة بالزيت المعدني ، وقم بتقطيع الماصة ، وقم بعمل كسر نظيف ، وكسر الماصة بنار الملقط ، وتلميع طرف الماصة وتثبيتها على حقنة صغيرة مثبتة في مناور صغير.

ثم اسحب مكبس الحقنة الدقيقة لملء الماصة بنانولترات من المخزن المؤقت للتفكك ووضع طرف الماصة فوق حجرة التدفق في نهاية الحضانة. بعد شفط المخزن المؤقت بعناية كما هو موضح للتو ، اغسل الأجزاء الشريانية بأربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للتفكك في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بسحب جزء واحد من الوعاء برفق باستخدام ماصة صغيرة سعة مليلتر واحد وضع الوعاء في غرفة تدفق مع مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتفكك.

ضع طرف ماصة الوعاء بالقرب من أحد طرفي جزء الوعاء الدموي ، ثم قم بشفط جزء الوعاء الدموي في الماصة عند حوالي 225 نانولترا في الثانية ، حتى لا تسبب إجهادا ميكانيكيا للخلايا البطانية ، قم بإخراج الوعاء مرة أخرى إلى الغرفة. إذا نجح الهضم ، فصل خلايا العضلات الملساء والسكر عن الأنبوب البطاني. حرك adventitia بعيدا عن الأنبوب البطاني في أسرع وقت ممكن لمنعه من تشابك الأنبوب ، ثم كرر tation كما هو موضح للتو حتى يتم فصل جميع خلايا العضلات الملساء.

بعد التكرار النهائي ، تم وضع ASEE ووضع الأنبوب البطاني المعزول في وسط غرفة التدفق ، محاذاة على طول اتجاه التدفق وإزالة الماصة المحفزة. قم بتثبيت ماصات التثبيت في معالجات دقيقة مثبتة في أي من طرفي غرفة التدفق ثم ضع أطرافها في طرفي الأنبوب البطاني المعني. اخفض ماصات التثبيت ، واحدة تلو الأخرى على طرفي نقيض من الأنبوب ، واضغط على الأنبوب على قاع الغرفة ، على بعد حوالي 50 ميكرومتر من كل طرف من طرفي الأنبوب.

تماما كما تلامس ماصة التثبيت الأنبوب ، قم بسحبها ببطء على طول محور الأنبوب ، وتمديدها إلى طولها التقريبي في الجسم الحي. اضغط على الماصة على قاع الغرفة لتأمين الأنبوب، ثم ابدأ في تدفق محلول الانصهار الفائق باستخدام مضخة تمعجية للحفاظ على التدفق المستمر لمحلول الانصهار الفائق عبر الأنبوب البطاني. في صورة تباين التداخل التفاضلي هذه ، يظهر أنبوب خلية بطانية معزولة من SEA التالي ، وهو عبارة عن انصهار فائق لمدة ساعة واحدة مع مخزن مؤقت للانصهار الفائق بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يوضح هذا الفيلم استجابات الكالسيوم لأنفلونزا أوه أربعة أنبوب خلية بطانية محملة استجابة لتحفيز أستيل كولين ميكرومولار واحد. تم جمع هذه الصور الفلورية التمثيلية في نقاط زمنية مختلفة بعد تحفيز الأنبوب البطاني باستخدام الأسيتيل كولين. لاحظ كيف يتذبذب الكالسيوم داخل الخلايا بمرور الوقت.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب إتلاف الأنبوب البطاني ميكانيكيا أثناء وضع الأنبوب البطاني وتثبيته لأن الخلايا البطانية حساسة للغاية ويمكن تلفها بسهولة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية عزل الأنابيب البطانية من الشريان الشرسوفي العلوي للفأر ، وبالتالي دراسة بطانة الأوعية الدموية الدقيقة السليمة الأصلية.