إجراءات لتحديد المعدية البريونات بعد المرور عبر الجهاز الهضمي لأنواع الطيور

الهدف العام من هذا الإجراء هو توثيق مرور مادة PreOn المعدية عبر الجهاز الهضمي للغربان الأمريكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس الغربان أولا بمادة PreOn المعدية. الخطوة الثانية هي جمع براز الغراب لمدة أربع ساعات بعد التزقيم وإعداده للحقن في الفئران.

بعد ذلك يتم تلقيح الفئران داخل الصفاق بمليلتر واحد من تجانس براز الغراب. الخطوة الأخيرة هي مراقبة الفئران يوميا حتى تعبر عن العلامات السريرية لكشط الفأر. في النهاية ، يتم استخدام تحليل اللطخة الغربية لتأكيد وجود PreOn المعدي في نموذج الفأر والتحقق من انتقال المرض.

فكرة أن الغربان يمكن أن تنقل. جاء CWD إلينا في أحد أيام الشتاء عندما بعد القيادة إلى منشأة الأيائل الأسيرة حيث كنا نجري بعض الأبحاث ورأينا الأيائل المقتولة على الطريق تتغذى عليها الغربان ، وفي وقت لاحق من ذلك اليوم ، خرجت الغربان من السماء إلى أي مكان ، وهبطت في أحواض الأعلاف هذه ، وتتغذى بجوار الأيائل مباشرة ، وتغوط على الحبوب التي كانت الأيائل تستهلك ذلك بالإضافة إلى الملاحظة من الأدبيات التي كان الكثير من الغربان في ذلك الصيف في جميع أنحاء كولورادو ، شتاء وايومنغ في منطقة مركزة في نيو مكسيكو ، يحدث أن تلك المنطقة في نيو مكسيكو هي المكان الذي ظهرت فيه بعض أمراض الملازم لسيارات التاجير وهي على بعد مائة ميل مئات الأميال من مركز مرض هزال الكراك. لذا جعلتنا هاتان الملاحظتان نعتقد أن الغربان المحتملة يمكن أن تلعب دورا في نقل CWD حول المناظر الطبيعية.

العرض المرئي لهذه التقنيات أمرا بالغ الأهمية لأن تقنيات التزقيم غير الصحيحة داخل الصفاق والفم يمكن أن تؤدي إلى موت الدراسة. للبدء ، أضف أربع قطرات من الصبغة الزرقاء إلى بيضة مخفوقة واخلطها جيدا. ثم ارسم خمسة ملليلتر من خليط الصبغة والبيض في إبرة تزقيم بوصتين مع قيام شخص واحد بتقييد الغراب برفق.

افتح منقار الغراب على نطاق واسع بما يكفي لرؤية حلقه وأدخل إبرة التزقيم بعناية في المريء. إذا لوحظ أي تغيير في التنفس ، فقم بإزالة المحقنة وحاول مرة أخرى لأنها قد تكون قد وضعت في القصبة الهوائية. بمجرد التأكد من وجود إبرة التزقيم في المريء ، عبر ببطء عن محتويات المحقنة.

افحص الغراب كل 30 دقيقة حتى لا يفرز البراز الملون باللون الأزرق والأخضر. استغرقت غربان الاختبار حوالي أربع ساعات للإقلاع عن إفراز البراز المصبوغ باللون الأزرق. بعد ذلك ، أضف جزءا واحدا غير مصاب C 57 من دماغ الفأر الأسود إلى أربعة أجزاء من PBS المعقم وبعض الخرز الزجاجي في خلاط الرصاص.

الخالط بتجانس العينة لمدة دقيقة إلى خمس دقائق حتى يتحقق الاتساق السلس. كرر العملية باستخدام سلالة R ML Chandler المصابة بمرض عضال C 57 أدمغة الفئران السوداء الستة الطرد المركزي التالي المتجانس عند 3000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

لإزالة الجسيمات الأكبر. ثم قم بإزالة المادة الطافية وتخفيفها بحجم متساو من XPBS المعقم لتوليد وزن 10٪ لكل حجم من مادة الدماغ. في PBS ، قم بتخزين العينات عند سالب 80 درجة مئوية حتى الحاجة إليها قبل 17 ساعة من التزقيم.

قم بإزالة الطعام ولكن ليس الماء من أقلام الغراب. قم بتخصيص الغربان بشكل عشوائي إلى مجموعات العلاج وقم بتجزيم كل غراب عن طريق الفم بخمسة ملليلتر من الذوبان الطازج ، أو تجانس دماغ الفأر الطبيعي أو المصاب باستخدام إبرة تزقيم بوصتين. ثم انقل الغربان إلى أقفاص فردية.

اجمع كل البراز وجمعه داخل كل قفص بعد أربع ساعات من التزقيم. بعد ذلك ، قم بتجانس البراز المجمع لكل غراب في مجانس رصاصة زرقاء بخرز زجاجي حتى يتم تحقيق نسيج موحد. ثم خذ 500 ميكرولتر من الخليط وقم بتخفيفه من واحد إلى 20 مع 9.5 مل من جهاز الطرد المركزي المعقم PBS ، وهو متجانس البراز المخفف لمدة 15 دقيقة.

أضف 1 ، 300 مرة جم ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. لتقليل خطر الإصابة بالعدوى الميكروبية الثانوية ، أضف وحدة واحدة من البنسلين وميكروغرام واحد من الستربتومايسين لكل مليلتر من المتجانس. ثم صوتنة العينات في جهاز 3000 ميجابكسل عند إعداد طاقة 70 لمدة 30 ثانية لتعطيل غشاء أي ميكروبات متبقية.

أولا ، قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي لإحدى المجموعات الأربع الموضحة هنا. ستتلقى المجموعة الأولى براز الغراب المصاب. ستتلقى المجموعة الثانية براز الغراب غير المصاب.

ستتلقى المجموعة الثالثة دماغ الفأر المصاب وستتلقى المجموعة الرابعة دماغ الفأر الطبيعي. ثم بالنسبة لمجموعتي MN الأولى والثانية ، ارسم ملليلترا واحدا من براز الغراب الموجب أو السالب الكاشط. تجانس باستخدام إبرة قياس 25 وفقا لرقم مجموعة الماوس.

ثم قم بتقطيع الفأر من فرو العنق الظهري. باستخدام الإبهام والسبابة وقم بتدويرها برفق لفضح الجانب البطني. ارفع الطرف الخلفي للفأر بحيث يكون رأسه أقل قليلا.

أدخل الإبرة سنتيمترا واحدا عبر الجلد ، سنتيمترا واحدا جانبيا من خط الوسط ومن سنتيمتر إلى سنتيمترين أمام المفصل العجزي الحرقفي. ثم تراجع قليلا وحقن المتجانس ببطء في تجويف جسم الفأر. بعد ذلك ، قم بإعداد دماغ الفأر المجمد المتجانس مع وبدون خردة للحقن في في المجموعتين الثالثة والرابعة.

عن طريق تخفيف مخاليط مخزون هاوس أولا من واحد إلى 10 مع PBS معقم. ثم حقن ملليلتر واحد من الدماغ الموجب المخفف المتجانس في الفئران في المجموعة الثالثة ومليلتر واحد من الدماغ السلبي المخفف المتجانس في الفئران. في المجموعة الرابعة.

راقب الفئران يوميا حتى تعبر عن العلامات السريرية لكشط الفأر. قد تشمل العلامات السريرية الحداب والرنح وتيبس الذيل وقلة الاستمالة والهزال والخمول. سجل يومي لكل علامة من العلامات السريرية الست.

عندما تكون العلامات المرئية واضحة. صفر يساوي عدم وجود علامات مرئية. واحد يساوي معتدلا واثنان يساوي مستوى شديدا من العلامة.

قتل الفئران عندما يصل إجمالي الدرجات اليومية لكل علامة إلى أكبر من أو يساوي ثمانية ليوم واحد أكبر من أو يساوي ستة بشكل مستمر لمدة ثلاثة أيام أو في 365 يوما. بعد التلقيح ، قم بحصاد الأدمغة مباشرة بعد القتل الرحيم وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية. ثم تخلص من الجثث بشكل صحيح لتأكيد التشخيص المتقطع.

قم بإذابة أدمغة الفئران المجمدة وتجانسها بشكل فردي في مجانس رصاصة زرقاء بخرز زجاجي حتى يتم تحقيق نسيج موحد. بعد ذلك ، قم بإعداد 125 ميكرولترا من محلول هضم البروتيناز K عن طريق الجمع بين 109.39 ميكرولتر من PBS مع 12.5 ميكرولتر من 500 ملليمولار EDTA عند درجة الحموضة ثمانية و 3.1 ميكرولتر من محلول 50 ميكروغرام لكل مليلتر بروتيناز K. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من محلول الهضم إلى 17 ميكرولترا من الدماغ. متجانس.

احتضان العينات عند 45 درجة مئوية على كتلة حرارية مهتزة لمدة 30 دقيقة. بمجرد الانتهاء من الحضانة ، قم بتعطيل محلول الهضم عن طريق إضافة ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحميل صفحة SDS ، واحتضان العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم قم بتحميل العينات في صفحة SDS بنسبة 12٪.

هلام كهربائي البروتينات ونقل الجل إلى غشاء IMON PVDF بمجرد نقله ، قم بسد غشاء PVDF بنسبة 5٪ من الحليب الخالي من الدسم في PBS مع 0.2٪ بين 20 والصخور لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بفحص الغشاء باستخدام الاقتراض 224 والجسم المضاد أحادي النسيلة IPRP المقترن ببيروكسيداز فجل الحصان المخفف من واحد إلى 20،000 في الكتلة الفائقة والصخور لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة. شطف الغشاء لمدة ساعة واحدة في PBS مع 0.2٪ بين 20.

تصور البروتينات عن طريق احتضان الغشاء بركيزة كيميائية لمدة خمس دقائق. ثم تصوير الغشاء على نظام توثيق هلام صندوق G. تم التعرف على الفئران المريضة من خلال ظهور علامات كشط الفئران السريرية وتم الانتهاء من تأكيد المرض عن طريق تحليل الدم الغربي.

دماغ الفأر العادي المتجانس مع عدم وجود كشط هنا في المسارين الأيسر مع وبدون مساعدة البروتياز K بدون بروتياز K ثلاثة انحناءات شوهدت. ومع ذلك ، نظرا لأن البروتين الطبيعي عرضة للبروتينات ، فلا تظهر الانحناءات في الممر الثاني. يظهر الممر الثالث عينة تحكم إيجابية مكشطة مهضومة بالبروتياز

تسبب البروتياز تحولا في النطاقات الثلاثة الأصلية بسبب فقدان الطرفين n و c للبروتينات. لكن البروتينات المصابة غير قادرة على الهضم تماما كما كانت في عينة الدماغ الطبيعية. يظهر الدماغ المهضوم بالبروتيناز K من فأر ملقح بالبراز من غراب ملقح متقطع على اليمين ويؤكد وجود البريونات في العينة حيث لا يتم هضم العصابات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم أكبر لكيفية توثيق مرور مادة البريون المعدية عبر الجهاز الهضمي للغربان. ثم تحقق من العدوى باستخدام الاختبار الحيوي للفأر بين الصفاق.