التحليل الكمي وتوصيف آفات تصلب الشرايين في الجيوب الأنفية الأبهرية الفئرانية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف وقياس آفات تصلب الشرايين في الجيب الأبهري MI. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح القلب المستخرج أولا من أجل فصل الجزء القمي وتحديد موقع الجيوب الأبهري. بعد ذلك يتم تحضير كتل البارافين بالجزء القمي المعالج من القلب.

ثم يتم تقسيم الجيب الأبهري وتثبيته على الشرائح. أخيرا ، أقسام الأنسجة ملطخة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أحجاما وتركيبات مختلفة من آفات تصلب الشرايين من خلال التحليل الكيميائي النسيجي والكيميائي المناعي.

وسيكون عرض الإجراء دانيال فينغا الجزاء، طالب الدراسات العليا من مختبري. وافق مجلس أخلاقيات أبحاث بجامعة ماكماستر مسبقا على جميع الإجراءات الموضحة هنا بعد تخدير فأر LDLR المزدوج السالبي واستخراج الدم القتل الرحيم وإصلاحه قبل عزل القلب وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مشرط لعمل قطع عرضي على القلب عموديا على الشريان الأورطي الصاعد. ضع الجزء القمي أو العلوي من القلب في شريط مدمج واغمره في فورمين.

ثم ضع الكاسيت في معالج المناديل وقم بمعالجته طوال الليل. باستخدام البرنامج الموضح في بروتوكول النص لقوالب الأنسجة ، تذوب شمع البارافين طوال الليل عند 62 درجة مئوية. ضع كل نسيج عملية في قالب نسيجية عميق ، مع التأكد من أن واجهة القلب تلامس قاعدة القالب ، ثم صب شمع البارافين المذاب لملء القالب بالكامل.

استخدم كاسيت بلاستيكي مكتوب عليه لتغطية القالب. بعد تبريد القوالب على الجليد أو على سطح بارد ، افصل الكتلة عن القالب لتقسيم الشريان الأورطي. ضع الكتلة في حامل عينة الميكروتوم بحيث يمكن تقسيمها من الداخل باتجاه الجزء العلوي من القلب.

اضبط الميكروتوم على 10 ميكرون وقسم القلب. اجمع الأقسام على شريحة زجاجية وفحصها تحت المجهر الضوئي لتحديد الموضع والاتجاه. يجب أن يظهر الجيوب الأنفية على شكل ثلاث قواعد صمام ثنائية الأجزاء مع وريقات متصلة.

عندما يصبح صمام أو صمامين من الجيوب الأنفية الأبهرية واضحا ، اضبط زاوية الكتلة حسب الضرورة. عند الوصول إلى الصمامات ، اضبط الميكروتوم لقطعه من أربعة إلى خمسة ميكرون. تركيب أول 10 أقسام في الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية الفردية ، ثم تركيب كل مجموعة لاحقة من 10 أقسام في الموضع التالي.

على الشرائح. استمر في جمع الأقسام حتى لا يتم ملاحظة آفة تصلب الشرايين. لتلطيخ الأقسام بالهيماتين و eoin لتصور الآفات ، ضع الشرائح في مجفف الهواء لمدة ثماني دقائق.

ثم قم بتقسيم الأقسام باستخدام الزيلين لغسلها أربع مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها. اغسل الشرائح في 100٪ إيثانول ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها. ثم 70٪ إيثانول و 50٪ إيثانول.

ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما. استخدم الماء المقطر لشطف الشرائح ثم اغمرها فيها. الهيماتين MA لمدة 15 دقيقة.

اغسل وركض. ماء الصنبور لمدة خمس دقائق. ثم اغسل الماء المقطر لمدة خمس دقائق بعد غمره في eoin Y لمدة دقيقة إلى خمس دقائق.

اغسل الماء المقطر ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما. 50٪ إيثانول مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم 70٪ إيثانول ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل غسلة ، و 100٪ إيثانول.

ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم اغسل والزيلين أربع مرات لمدة دقيقتين لكل منهما. استخدم وسيط تركيب قائم على الزيلين لتركيب الأقسام والتقاط الصور تحت المجهر الضوئي.

استخدم برنامج التصوير لتحديد الآفات وتحديدها كميا ، والتي يمكن تحديدها على مسافات محددة من الجيوب الأنفية الأبهرية على فترات تتراوح من 40 إلى 50 ميكرون ، اعتمادا على سمك الأقسام ، راجع البروتوكول النصي للتلطيخ الكيميائي المناعي والتألق المناعي. عمر خمسة أسابيع LDLR. تم تغذية الفئران الإيجابية بنظام غذائي قياسي أو نظام غذائي غني بالدهون لمدة 10 أسابيع قبل أن يتم إصلاح قلوبها وعزلها وتقسيمها كما هو موضح هنا.

عندما تتغذى الفئران على نظام غذائي قياسي ، يكون تطور تصلب الشرايين محدودا للغاية وقد لا يمكن اكتشافه في 15 أسبوعا من الثامنة. يعمل النظام الغذائي الغني بالدهون على تسريع تكوين الشرايين بشكل كبير في هذا النموذج ويحفز تكوين آفات متقدمة كبيرة تحتوي على نوى مزمنة غير خلوية وقبعات ليفية. يمكن أيضا تمييز آفات تصلب الشرايين من خلال تلطيخ وجود أنواع وعوامل معينة من الخلايا تحدد مراحل تطور الآفة.

يمثل تسلل الخلية الوحيدة إلى البطن أحد أقدم أحداث تكوين الشرايين البطنية. تتمايز الخلايا الوحيدة إلى ضامة تبتلع الحطام الخلوي والدهون. تخلق البلاعم المحتقنة بالدهون والمعروفة باسم الخلايا الرغوية خطا دهنيا في جدار الشريان كما هو موضح هنا.

يمكن اكتشاف خلايا رغوة البلاعم في جميع مراحل تطور الآفة عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة ضد علامات البلاعم المحددة مثل F four و 80 و MAC three. تقتصر خلايا العضلات الملساء الوعائية أو الخلايا المتنقلة العضوية على الطبقة الإنسية للشريان السليم. يتم تحفيز VSCs للهجرة والتكاثر في البطن أثناء تطور آفة متقدمة.

كما يتضح من هذه اللوحة ، يمكن التعرف على V SMCs عن طريق تلطيخ الجسم المضاد ضد ألفا أكتين بعد تطوره. دفعت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض القلب والأوعية الدموية لاستكشاف تطور وتطور آفات تصلب الشرايين في القضبان.