Centrosomes التصوير في يطير الخصية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام علامات Centro Somal ذات العلامات الوراثية للكشف عن الطفرات الجينية الجديدة والكشف عن وظيفة الجينات الجسدية المركزية المحددة حديثا. يمكن تحقيق ذلك من خلال ثلاث استراتيجيات تصوير مختلفة. تتبع تصوير الخصيتين الحية أو المسار B أو التثبيت الكيميائي للخصيتين أو تلطيخ المسار المناعي C.

تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في عزل خصيتي الذباب التي تعبر عن البروتينات الجسدية المركزية الموسومة وراثيا ، والتي يمكن أن يتبعها التصوير الفوري. الخطوة الثانية هي إصلاح الخصيتين كيميائيا ، والتي يمكن أن يتبعها أيضا التصوير. ثالثا ، يمكن تلطيخ الخصيتين مناعية ثم تصويرهما.

في النهاية ، يتم تحديد مواقع البروتينات المركزية عن طريق المجهر الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المنطقة المركزية ، مثل الأساس الجزيئي للتكوين المركزي ، والاستطالة المركزية ، والفصل المركزي. ابدأ بعزل ذبابة الفاكهة الخصيتين كما هو مفصل في منشور JoVE 2 6 4 1.

بعد عزل الخصيتين ، اغمر العينة في ستة ميكرولترات من المخزن المؤقت الملطخ المزعج بدرجة حرارة الغرفة المحضر حديثا على شريحة مجهر زجاجي موجب الشحنة. انتظر 10 دقائق ، ثم اغسل DPI الزائد برفق عن طريق استبدال المخزن المؤقت للتلطيخ مرتين. مع ستة ميكرولتر من PBS.

احرص على عدم غسل الخصيتين. قم بإزالة المحاليل من الشريحة باستخدام قطعة من ورق الترشيح لإزالتها. تعمل ستة أحجام ميكرولتر بشكل جيد مع زلات غطاء 18 ملم مربع.

يساعد الآن استخدام مشرط حاد لاختراق الخصيتين بالقرب من نوع الخلية محل الاهتمام ، وهذا يقلل من الضغط على هذه الخلايا أثناء خطوة السحق. ثم ضع بعناية زلة غطاء فوق العينة وأغلقها بطلاء الأظافر. ثم حدد موضع الخصيتين على الشريحة بقلم وانتقل إلى التصوير.

بعد عزل الخصيتين ، اغمرهما في قطرة ستة ميكرولتر من PBS فوق شريحة مجهر زجاجي موجب الشحنة. قم بتوجيه الخصيتين يدويا بطريقة خطية أو كما هو مفضل. ثم استخدم قطعة من ورق الترشيح لإزالة PBS واستبداله بستة ميكرولترات من المخزن المؤقت الثابت المعد حديثا.

بعد خمس دقائق في المخزن المؤقت الثابت ، قم بإزالته بقطعة من ورق الترشيح. الآن اغمر العينة في ستة ميكرولترات من مخزن تلطيخ DPI المحضر حديثا لمدة 10 دقائق. اغسل DPI عن طريق استبداله بمجلدين سعة ستة ميكرولتر من PBS.

ثم ضع بعناية زلة غطاء مقاس 18 ملم مربع فوق العينة وأغلقها بطلاء الأظافر. ثم حدد موقع الخصيتين على الشريحة وتابع التصوير. لهذا الإجراء أولا ، قم بإعداد بعض زلات الغطاء المصنوعة من السيليكون.

أولا ، اغمر زلات الغطاء في صينية صغيرة من محلول السيليكون لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان ، وتأكد من أن زلات الغطاء مكشوفة بالكامل وليست مكدسة فوق بعضها البعض. بعد ذلك ، اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات في الماء لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة. اتبع ذلك بثلاث غسلات لمدة دقيقة واحدة في 70٪ من الإيثانول وغسل آخر لمدة دقيقة واحدة في الماء.

ثم اترك زلاقات الغطاء المصنوع من السيليكون تجف في الهواء تحت غطاء الدخان. بعد تشريح العديد من الخصيتين وقبر شريحة بنوع العينة ، أضف خمسة ميكرولترات من PBS إلى زلة الغطاء المصنوعة من السيليكون وانقل الخصيتين إلى قطرة PBS. هناك حاجة إلى العديد من زلات الغطاء لكل منها خصيتين واحدة لضمان النجاح.

بعد ذلك ، تحت مجهر التشريح ، اخترق كل من الخصيتين بعناية كما هو موضح سابقا. الآن ، ضع برفق مجهر زجاجي موجب الشحنة. قم بالتمرير فوق زلة الغطاء ، مما يسمح ل PBS بالتشتت بالتساوي بين زلة الغطاء والشريحة.

ثم قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من بين زلة الغطاء والانزلاق ، مما يزيد من الضغط على الخصيتين ويسحقهما. الآن قم بإسقاط الشريحة المحضرة في النيتروجين السائل. يمكن الآن تحضير المزيد من الشرائح وإضافتها إلى الخزان.

قبل الشروع في استخدام ملقط كبير ، قم بإزالة إحدى الشرائح من النيتروجين السائل واستخدم مشرطا بسرعة لإزالة زلة الغطاء. يجب أن تبقى العينة على الشريحة أثناء إزالة زلة الغطاء من العينة. احرص على عدم تشويهها على طول سطح شريحة S.

يمكن تحقيق ذلك باستخدام مشرط لقطع انزلاق الغطاء بحركة واحدة سريعة. الآن احتضان الشرائح في جرة تلطيخ زجاجية مملوءة بالميثانول. تبرد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، انقل الشرائح إلى جرة تحتوي على الأسيتون. يبرد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر بعد 30 ثانية في الأسيتون. اغسل الشرائح لمدة دقيقة في PBS في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، احتضن الشرائح لمدة 10 دقائق في PBST المعدة حديثا لمنع المواقع غير المحددة أثناء حضانة السل PBS ، املأ آبار غرفة الرطوبة بالماء بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الشرائح من PBST وجفف كل شريحة حول العينة. احرص على عدم تجفيف العينة نفسها. حيث يتم تجفيف كل شريحة.

ضعه في غرفة الرطوبة. من المهم تجفيف منطقة الشريحة المحيطة بالعينة قبل إضافة محلول الجسم المضاد. هذا يضمن بقاء الجسم المضاد موضعيا على العينة ، وبالتالي يمنع الجفاف أثناء خطوة الحضانة.

ثم قم بإسقاط 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف في P-B-S-T-B-R المحضر حديثا على العينات. استخدم مخففا من واحد إلى 200 للأجسام المضادة غير المميزة. ثم ضع قطعة مترا مربعة من الطفيلي فوق العينة لنشر محلول الجسم المضاد وحماية محلول الجسم المضاد من التبخر.

اسمح للعينات بالتحتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة ، استخدم الملقط لإزالة الطفيلي برفق من الشرائح. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى غرفة الرطوبة مع توجيه العينة لأعلى ، أضف برفق 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في PBST ، BR على العينات. كما كان من قبل ، قم بتطبيق paraform وانتظر ساعة من الغسيل الثانوي بثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBST ثم ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS. ثم امسح الشرائح بعناية حتى تجف دون لمس العينات.

أضف ستة ميكرولترات من وسائط التثبيت وقم بتطبيق زلة غطاء قياسية. بعد إغلاق زلة الغطاء بطلاء الأظافر وتحديد موضع الخصيتين ، تابع التصوير. تخضع الجسيمات المركزية لتحولات مورفولوجية ووظيفية متعددة على مدار تكوين المنوية.

إحدى العمليات التي يمكن ملاحظتها بسهولة هي استطالة الجسيم المركزي في المنوية ، وعلامة LAR ANA one GFP تشير إلى طول 0.6 ميكرون ، ويستطيل هذا الأولي. نظرا لأن زيوت سنتري ذبابة الفاكهة للحيوانات المنوية طويلة بشكل فريد ، يمكن استخدام التصوير للإدلاء ببيانات كمية فيما يتعلق باستطالة الجسيم المركزي. بالمقارنة مع مورفولوجيا النوع البري ، تم تحديد طفرات مختلفة تغير النمو المركزي.

هناك مثالان دائما في وقت مبكر وطفرات قذيفة المدفع التي تعوق تكوين المنوية قبل ظهور الانقسام الاختزالي ، ولكنها لا تمنع استطالة السنت في هذه الطفرات تنمو زيوت المائة من الخلايا المنوية الناضجة إلى حوالي 2.4 ميكرون مقارنة بزيوت السنت من الخلايا الضابطة ، والتي يصل طولها إلى 1.8 ميكرون كحد أقصى. بمجرد إتقان المسار A ، يمكن إجراؤه في 20 دقيقة ، والمسار B في 30 دقيقة والمسار C في ثلاث إلى خمس ساعات حسب حجم العينة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير الجسيم المركزي أثناء الطيران.