عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الدبقية القشرية من حديثي الولادة في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الميكرو الأول لأنسجة المخ القشرية من حديثي الولادة مورين. الخطوة الثانية هي زراعة مزارع الخلايا الدبقية المختلطة لمدة 17 إلى 21 يوما في المختبر.

بعد ذلك ، يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن هذه الثقافات الدبقية المختلطة. الخطوة الأخيرة هي صفيحة الخلايا الدبقية الصغيرة في ألواح زراعة الخلايا لمزيد من التجارب. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري وإليزا لإظهار أن بروتوكول العزل هذا يحافظ على النمط الظاهري للمناعة الدبقية الصغيرة ووظائفها.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب إجراء SEP المتورط في التشريح المجهري الدقيق. يتطلب التنفيذ الناجح لهذا الإجراء السرعة والدقة. هذا بطيء جدا سيقلل من إنتاجية الخلايا بينما ستؤدي الإزالة غير الكاملة للسحايا إلى تلويث الثقافة الدبقية وإعاقة نمو الخلايا الدبقية.

ابدأ بإعداد الوسائط الكاملة للخلايا الدبقية الصغيرة المشار إليها فيما يلي باسم MCM. قم بإعداد قارورة واحدة لكل جرو واحتضانها لمدة ساعة واحدة على الأقل. خطوة التوازن هذه ضرورية للنجاح.

بعد ذلك ، قم بإعداد aliquot والتبريد على الجليد. جميع الوسائط المطلوبة تحتوي على ستة ملليلتر من MCM لكل جرو وتدفئها في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل التشريح. امسح محطة عمل تدفق الهواء الأفقية ومجهر التشريح باستخدام 70٪ من الإيثانول.

بعد ذلك ، ضع الأدوات الجراحية المعقمة اللازمة للإجراء في منطقة العمل. قم بإعداد طبق معقم مع وسائط تشريح لالتقاط الرأس وآخر للتشريح. قم بتوزيع وسائط الفرم في طبقها الخاص لفرم أنسجة المخ.

بعد قطع الرأس واستخراج الدماغ ، ضع الدماغ المعزول حديثا تحت مجهر تشريح لتصور المجاملات ، مع التأكد من الحفاظ على الجانب الظهري لأعلى وجافا. قم بتأمين الدماغ عن طريق إدخال أطراف الملقط في تقاطع الدماغ المتوسط والقشرة. بمجرد وضعه في مكانه ، قم بإزالة السحايا القشرية الظهرية تماما.

بعد ذلك ، قم بإزالة السحايا البطنية لزيادة نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة والعائد. من الضروري إزالة جميع الأنسجة السحائية تماما. افصل القشرة عن بقية الدماغ.

تأكد من إزالة أي سحايا قشرية متبقية قد تكون موجودة على الجانب البطني أو الإنسي من القشرية. بعد إزالة الأنسجة السحائية ، ضع القشرة في طبق الفرم المحضر مسبقا. العمل في خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية ، استخدم المقص لفرم أنسجة المخ.

انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي 15 ملم. اشطف كل من المقص وطبق الفرم بملليلتر واحد من وسائط الفرم لكل منهما لزيادة الغلة. اجمع هذه الشطف ووزعه في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على الأنسجة المفرومة.

اترك تعليق الأنسجة دون إزعاج لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، مما يسمح للأنسجة المفرومة بالاستقرار في قاع الأنبوب. بعد هذا الوقت ، قم بإزالة ملليلترين من المادة الطافية والتخلص منها بعناية ، مع الحرص على عدم تعطيل الأنسجة المفرومة المستقرة. أضف ثلاثة ملليلتر من MCM الدافئ مسبقا إلى الأنسجة المفرومة ، ثم قم بتقطيع الأنسجة بقوة.

يجب ألا يبقى أي نسيج صلب يمكن تمييزه عند اكتمال trier. أضف ثلاثة ملليلتر أخرى من MCM باستخدام نفس طرف الماصة لجمع العينة الثلاثية المتبقية من الحافة. بمجرد جمعها ، قم بالطرد المركزي للأنسجة المفرومة لحبيبات الخلايا.

عند الانتهاء ، أعد الخلايا المحببة إلى خزانة السلامة البيولوجية. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية. ريسوس بلطف.

قم بتعليق حبيبات الخلية بملليلترين من MCM الدافئ ، ثم أضف تعليق إعادة تشكيل الخلية إلى القارورة المعدة مسبقا. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، اضغط برفق على القارورة على راحة اليد لتعطيل بقايا الأنسجة.

افحص الخلايا قبل النقر وبعده للتأكد من إزالة الحطام بالكامل. بعد ذلك ، استبدل الوسائط ب MCM جديد وأعد القارورة إلى الحاضنة. افحص الخلايا يوميا لمراقبة النمو والتلوث.

بعد ما يقرب من 17 إلى 21 يوما ، ستكون الخلايا الدبقية الصغيرة جاهزة للحصاد لتحديد ما إذا كانت الخلايا جاهزة ، وفحصها تحت مجهر تباين الطور المقلوب. الخلايا الدبقية الصغيرة جاهزة للحصاد. عندما تصل إلى ما يقرب من 40٪ من الطلاقة المشتركة ، فإنها تظهر كخلايا كروية صغيرة ومشرقة تنمو كطبقة أحادية فوق الأخرى.

للعزل ، انقر على الخلايا الدبقية الصغيرة بقوة على القارورة على مقعد المختبر. يساعد هذا التحريض على فصل الخلايا الدبقية الصغيرة عن الخلايا الدبقية الأخرى بسبب خصائص الالتصاق المنخفضة للخلايا الدبقية الصغيرة. أغلق أغطية القارورة بالشكل الشكلي وقم بتدوير المزارع الدبقية المختلطة باستخدام شاكر دوار غير مرطب يتم التحكم في درجة حرارته لمدة خمس ساعات.

بعد هذا الوقت ، افحص بصريا أن الخلايا الدبقية الصغيرة قد رفعت عن سطح القارورة. باستخدام مجهر تباين الطور المقلوب ، الخلايا الدبقية عبارة عن خلايا كروية ساطعة عائمة بحرية. ستكون هناك طبقة متبقية من الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن تلتصق بقاع القارورة.

بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم وحنك. ريسوس. قم بتعليق الحبيبات الدبقية الصغيرة في وسط نمو الخلايا الدبقية الصغيرة الدافئ وتحديد تركيز الخلية باستخدام لوحة مقياس الخلوي الدموي. تنزلق الخلايا الموجودة على شكل لوحة 24 بئرا على غطاء بلاستيكي أو زجاجي معقم بعد 24 ساعة.

استبدل الوسائط ب MGM الدافئ الطازج لإزالة الخلايا العائمة والحطام. هذه الخطوة ضرورية لبقاء الخلايا وللحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة الهادئة ، تكون خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة جاهزة للتجريب مباشرة بعد خطوة إعادة التغذية هذه لتقييم نقاء الخلايا الدبقية الدقيقة. تم تلطيخ مزارع الخلايا المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تعبر داخليا عن GFP لمستضد البلاعم IBA one وملطخة ب dapi.

من أجل تصور نواة الخلية ، أظهرت أكثر من 95٪ من الخلايا تموضع مشترك ل GFP IBA واحد و dpi. بعد تحدي الخلايا باستخدام LPS ، تبنت الخلايا الدبقية الصغيرة تغييرا مورفولوجيا صارخا من نمط ظاهري ثنائي صغير إلى شكل يشبه الأميبويد. تلطيخ كيميائي نباتي مناعي ل P 65 دليل على أنه في ظل الظروف العادية ، يكون P 65 موضعيا بشكل منتشر في جميع أنحاء السيتوبلازم.

بينما بعد ساعتين من التعرض ل Pam P 65 ، أدى النشاط المناعي إلى تحويل التوطين بشكل كبير إلى نواة الخلية لتأكيد أن الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة احتفظت بوظيفتها المناعية الكيميائية الحيوية. تم تحديد إفراز السيتوكين المؤيد للالتهابات TNF alpha بعد التعرض ل PAM أو LPS. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الدبقية القشرية عن الأطفال حديثي الولادة المتطابقين للحصول على أفضل النتائج.

من المهم الحفاظ على تقنية معقمة وإزالة الأنسجة السحائية تماما من المنطقة القشرية التشريح.