A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ارتباط الببتيدات القصيرة ب معقد التوافق النسيجي الكبير البشري ، واثنين من البروتينات المناعية باستخدام مقايسة لوحة البئر 3 84 عالية الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء فحوصات ملزمة لمنافسة مرحلة الحل الأولى مع الببتيدات ذات الاهتمام. في الخطوة الثانية ، يتم التقاط معقدين من الببتيد المعقد الكبير المتوازن بجسم مضاد لمعقد التوافق النسيجي الكبير تم تجميدهما على ألواح ELIZA عالية الارتباط.

بعد ذلك ، يتم تحضين المجمعات التي تم التقاطها بالأفيون المسمى ستربتافيدين ثم يتم غسل الستربتافيدين غير المرتبط ويتم تنشيط الأفيون الملتقط. في النهاية ، يمكن استخدام القياس الفلوري الذي تم حله بالوقت لتحديد مستويات معقد التوافق النسيجي الكبير اثنين من ببتيد التحكم الملتقط. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى أولية حول الإمكانات المناعية للبروتينات المستهدفة.

إنه مفيد بشكل خاص للتحقق من صحة ناتج في تنبؤات السيليكو ، ابدأ الإجراء بإضافة 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة L 2 43 المخفف حديثا إلى كل بئر من 3 84. حسنا ، صفيحة ELIZA بيضاء عالية الربط أغلقت اللوحة بغشاء بوليستر واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم ابدأ بمخزون 10 مللي مولار لكل اختبار.

يصنع الببتيد و DMSO سلسلة التخفيف التالية ومخزن فوسفات السترات باستخدام 3 84 ألواح بولي بروبيلين جيدة. لاحظ أن لوحة البولي بروبلين الكاملة 3 84 جيدا تتطلب ثلاث لوحات EIA منفصلة كما هو موضح. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلولي مخزون معقد التوافق النسيجي الكبير المحددين إلى تركيز 101 نانو مولار في المخزن المؤقت للتفاعل باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

ثم قم بتخفيف ببتيد التحكم من 20 ميكرومولار إلى نسبة واحد إلى 100 في مزيج MHC اثنين من المزيج الرئيسي المحضر حديثا وأضف 21.5 ميكرولتر من مزيج معقد التوافق النسيجي الكبير مع ببتيد التحكم إلى التحكم الإيجابي. حسنا من لوحة البولي بروبيلين 3 84 بئر ، أضف مزيج معقد التوافق النسيجي الكبير الاثنين الذي يحتوي على ببتيد التحكم إلى كل من تخفيفات ببتيد الاختبار بنسبة واحد إلى واحد لإنشاء تفاعل الربط في هذا الوقت أيضا. أخيرا ، قم بإغلاق تفاعل الربط بغشاء بوليستر واحتضان اللوحة لمدة 12 إلى 24 ساعة في حاضنة يتم التحكم فيها بثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.

في اليوم التالي ، قم بتخفيف آبار تفاعل الربط في 3 84. لوحة البئر بنسبة واحد إلى واحد مع عازلة تحييد. ثم اغسل لوحة Eliza ثلاث مرات ب 60 ميكرولتر لكل بئر من PBS 0.05٪ بين 20 النقل التالي ، 25 ميكرولترا من كل محلول تفاعل ربط محايد من لوحة البئر 3 84 في ثلاث نسخ إلى الجسم المضاد المطلي 3 84.

حسنا ، تقوم لوحة Eliza بعد ذلك باحتضان لوحة ELIZA المغطاة بغشاء بوليستر عند أربع درجات مئوية طوال الليل بعد الحضانة. اغسل طبق ELIZA ثلاث مرات كما هو موضح للتو ، ثم أضف 25 ميكرولترا من الأفيون العقدي المخفف حديثا إلى كل منها. احتضان اللوحة المغطاة بغشاء بوليستر في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

أثناء الحضانة ، أحضر 10 مل من محلول التحسين لكل طبق إلى درجة حرارة الغرفة أيضا في الظلام بعد ساعة واحدة ، واغسل لوحة ELIZA كما هو موضح ، ثم أضف 25 ميكرولترا من محلول التحسين لكل بئر واحتضان اللوحة المغطاة بغشاء بوليستر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في الظلام. أخيرا ، اقرأ التألق باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت الذي تم حله بمرور الوقت مع إعدادات الأفيون. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحليل تسلسل الببتيد الناضج من البكتيريا المعوية Cloe P تسعة تسعة بيتا لاكتاماز بحثا عن روابط الببتيد المفترضة لأليل معقد التوافق النسيجي الكبير ثنائي.

تم تحديد DRB واحد خمسة عشر أوه مائة وسبعة عشر غير أو ببتيدات مع بقايا مرساة إلزامية P واحدة في الموضع الأول المطلوب لمعقد التوافق النسيجي الكبير الثاني عند عتبة 5٪ فقط. من المحتمل أن تكون الببتيدات ذات الدرجات أكبر من أو تساوي 2.6 هي مواد مرتبطة. وبالتالي ، عند عتبة 5٪ ، من المتوقع أن تربط أعلى 11 ببتيدا فقط معقد التوافق النسيجي الكبير اثنين DRB 1 15 0 1.

تم اختيار لجنة تمثيلية من الحلقات المتوقعة للتحليل في هذا الاختبار المعقد النسيجي الكبير اثنين ملزمة. تم تصنيع شظايا ببتيد بيتا لاكتاماز من هذه البقايا ال 15 كيميائيا بحيث تم تضمين اثنين من حواتم معقد التوافق النسيجي الكبير المفترضة داخل شظايا البروتين الاصطناعية. ثم تم تحليل قدرة هذه الببتيدات الاصطناعية على التنافس مع ببتيد التحكم في بروتين المايلين الأساسي البيوتينيل للارتباط ب MHC two DRB 1 15 0 1 كما هو موضح للتو.

توضيح منحنيات الربط التنافسية للببتيدات الاصطناعية هنا. تم حساب قيم IC 50 عن طريق تركيب بيانات تحويل السجل باستخدام وظيفة الملاءمة غير الخطية للربط التنافسي في موقع واحد للمنشور. كما هو موضح في الجدول كما هو موضح في الرسم البياني ، تم تقسيم الببتيدات بشكل طبيعي إلى ثلاث مجموعات ، مواد رابطة قوية مع IC 50 أقل من واحد ميكرومولار مواد رابطة معتدلة مع IC 50 أكبر من أو يساوي ميكرومولار واحد ، ولكن أقل من 100 ميكرومولار ومواد رابطة ضعيفة مع IC 50 أكبر من أو يساوي 100 ميكرومولار بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات المناعة الجزيئية وتصميم العلاج الحيوي لاستكشاف أحداث التعرف الجزيئي الرئيسية التي تكمن وراء الاستجابات المناعية المضادة للبروتين لدى المرضى من البشر.