بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

الهدف العام من هذا الإجراء هو استقصاء المراحل المختلفة لدورة تضاعف فيروس التهاب الكبد C. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توليد نسخ من الحمض النووي الريبوزي الجينومي لـ HCV من بنيات بلازميد HCV الخطية. وتتمثل الخطوة الثانية في ترانسفكشن الخلايا بـ H-C-V-R-N-A. بعد ذلك، يتم توزيع الخلايا في أطباق لنقاط زمنية ومقايسات مختلفة. والخطوة النهائية هي جمع السائل الطافي من المزرعة الخلوية لقياس العيار الفيروسي وحصاد الخلايا التي تم ترانسفكشنها لاستخلاص البروتين وRNA. وفي النهاية، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (reverse transcription-PCR)، وبصمة ويسترن (Western blotting)، ومقايسة التألق المناعي، وقياس عيار HCV، وهو ما يثبت وجود نظام مزرعة خلوية معدية وقوي لفيروس HCV.

تتمثل الميزة الرئيسية لنظام المزارع الخلوية لفيروس التهاب الكبد C المعدي هذا، مقارنة بنظام ريبليكون HCV، في إمكانية استقصاء خطوات دخول الفيروس وتجميع الفيريونات وخروجها. ويمكن لهذا البروتوكول أن يساعد في الإجابة على الأسئلة الجوهرية في مجال فيروسات التهاب الكبد C، مثل تشكل الفيريونات، والتفاعل بين المضيف والممرض. وتمتد تطبيقات هذه التقنية إلى تطوير اللقاحات، حيث تتيح توصيف السلالات الفيروسية الموهنة التي يمكن تقييمها كمرشحات محتملة للقاحات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول فيروس التهاب الكبد C، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على فيروسات RNA الأخرى في عائلة Flaviviridae. وبوجه عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة تحدياً في استخلاص RNA جينومي عالي الجودة لفيروس HCV. وقد أصبح دراسة دورة التكاثر الكاملة لفيروس HCV ممكنة في المزارع الخلوية عقب اكتشاف عازلة من فيروس HCV من النمط الجيني 2A المسبب لالتهاب الكبد الياباني الخاطف. ويعد العرض المرئي للمقايسة الفيروسية أمراً بالغ الأهمية لأن هذه المقايسة تتطلب خبرة في كل من التقنيات الجزيئية والخلوية.

باستخدام فيروس خيمري 2A داخل النمط الجيني، وF-N-X-H-C-V وفيروس HCV خالي من البوليميراز (pol-null) لتقييم التكاثر الفيروسي، قم بعمل خطية للبلازميدات الفيروسية التي تم إنشاؤها مسبقاً عن طريق الهضم باستخدام إنزيم القطع XBA-one في أنبوب سعة 2 mL. بعد ذلك، قم بمعالجة البلازميدات باستخدام نوكلياز الفاصوليا المونج (mung bean nuclease) لإنشاء نهايات غير حادة.

قم بتنقية البلازميدات المهضومة باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني. وتحقق من سلامة البلازميد الخطي عن طريق إخضاع الحمض النووي DNA للفصل الكهربائي بهلام الأغاروز. بعد ذلك، أضف قالب الحمض النووي DNA للبلازميد الخطي إلى أنبوب سعة 0.2 مل يحتوي على مكونات تفاعل T-seven RNA polymerase لتخليق نسخ من الحمض النووي الريبي RNA الجينومي لفيروس HCV.

قم بتنقية الـ RNA المُصنّع حديثاً والمعالج بإنزيم DNase باستخدام طقم تنقية الـ RNA. ثم تحقق من إنتاج الـ RNA عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز. بعد ذلك، قم بتحديد كمية الـ RNA باستخدام القياس الطيفي.

قم بفصل الخلايا الملتصقة من سلالة Huh-7 باستخدام المعالجة بإنزيم التربسين واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. بعد القيام بعمليتي طرد مركزي متتاليتين، أعد تعليق كتلة الخلايا في وسط غذائي بارد منخفض المصل. وبعد تكرار عملية الطرد المركزي، أعد تعليق الخلايا في وسط غذائي منخفض المصل بتركيز 1×10⁷ cells per milliliter.

بعد ذلك، اخلط إجمالي 10 µg من الـ RNA الفيروسي المنسوخ مع 400 µL من الخلايا المعاد تعليقها في كيوفيت التثقيب الكهربائي (electroporation cuvette) بسعة 0.4 cm مبرد مسبقاً. قم بإدخال الـ RNA الفيروسي إلى الخلايا باستخدام التثقيب الكهربائي عند 270 volts و100 ohms و950 µF. عند الانتهاء، أعد تعليق الخلايا المثقبة كهربائياً في 10 mL من وسط نمو كامل يحتوي على 15% FBS. في هذه المرحلة، ازرع الخلايا في كل من دوارق T 25 بمعدل 1.2 × 10⁶ خلية لكل دورق، وفي أطباق ذات 48 بئراً بمعدل 1 × 10⁴ خلية لكل بئر، وذلك لنقاط زمنية تبلغ 4 و48 و96 ساعة. استبدل الوسط بعد 4 إلى 8 ساعات من عملية التعداء (transfection) بوسط نمو طازج ومكمل يحتوي على 10% FBS لإزالة حطام الخلايا الميتة من الدوارق والأطباق المستزرعة.

استخدم ماصة مصل لجمع طافات المزارع الخلوية عند النقطتين الزمنيتين 48 و 96 ساعة في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. بعد ذلك، قم بإزالة الحطام الخلوي من العينات المجمعة عن طريق الطرد المركزي بسرعة 15, 000 rpm لمدة 10 minutes عند درجة حرارة four degrees Celsius. بعد عملية الطرد المركزي، تُحفظ الطافات الخالية من الخلايا عند درجة حرارة negative 80 degrees Celsius.

قم بتحليل الخلايا لاستخلاص البروتين وRNA من أجل التحليل بواسطة لطخة ويسترن وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي أو RT-qPCR في النقاط الزمنية المحددة. قم بإجراء النسخ العكسي لـ 1 µg من RNA الخلوي الكلي باستخدام إنزيم النسخ العكسي وبادئ محدد لسلسلة HCV الحسية التي ترتبط بالمنطقة غير المترجمة في الطرف 5' في أنبوب سعة 0.2 mL. قم أيضاً بإجراء النسخ العكسي لـ F-N-X-H-C-V-R-N-A من نسخ جينومية معروفة باستخدام بادئ لسلسلة HCV الحسية. وباستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي، قم بإجراء qPCR باستخدام 50 ng من cDNA المنسوخ الناتج، وذلك باستخدام بادئات HCV محددة ومزيج qPCR فائق يحتوي على صبغة DNA الخضراء الرابطة. استخدم الظروف التالية عند تشغيل qPCR لتحديد عدد نسخ H-C-V-R-N-A. بعد إجراء qPCR، قم بفصل نواتج تحليل الخلايا من RNA الفيروسي المنقول بعد 96 ساعة من النقل باستخدام SDS page. ثم انقل البروتينات المفصولة في الهلام إلى غشاء polyvinylidene difluoride باستخدام طريقة trans-blot turbo. قم بحجب الغشاء باستخدام محلول حجب يحتوي على 5% skim milk و 0.2% tween-20 في PBS ووضعه في حاوية.

قم بتحضين الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة للفأر NS3 بتخفيف 1 إلى 1000، ومع beta-actin بتخفيف 1 إلى 5,000 في غرفة باردة عند درجة حرارة 4 °C. بعد التحضين، أضف الجسم المضاد من الماعز ضد الغلوبولين المناعي G للفأر المقترن ببيروكسيديز الفجل الحار بتخفيف 1 إلى 5,000، ثم قم بالكشف عن طريق التألق الكيميائي.

عند هذه النقطة، يتم تثبيت الخلايا المنقولة بـ H-C-V-R-N-A باستخدام الميثانول لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 20- درجة مئوية لإجراء مقايسة التألق المناعي. وعند الانتهاء، تُغسل الخلايا بـ PBS ثلاث مرات. بعد الحجب باستخدام محلول الحجب الخاص بمقايسة التألق المناعي، يُستخدم الجسم المضاد الأولي anti-NS5A متعدد النسائل من الأرانب والجسم المضاد أحادي النسيلة anti-DSRNA J2 من الفئران بتخفيف 1:200، ويُحضن الخليط لمدة تتراوح من خمس ساعات إلى ليلة كاملة في غرفة باردة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. وبعد التحضين، تُغسل الخلايا بـ PBS ثلاث مرات بعد إضافة الجسم المضاد الأولي. ثم يُضاف الجسم المضاد الثانوي متعدد النسائل goat anti-rabbit immunoglobulin-G 488 والجسم المضاد الثانوي متعدد النسائل goat anti-mouse immunoglobulin 594 بتخفيف 1:1000، ويُحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على هزاز مكتبي. وبعد غسل الخلايا بـ PBS ثلاث مرات، يتم صبغ النوى باستخدام صبغة Hoechst وتُفحص باستخدام مجهر فلوري.

بعد ذلك، قم بزراعة خلايا Huh7.5.1 الساذجة بكثافة تقارب 3 × 10³ خلية لكل بئر باستخدام طبق ذي 96 بئراً. في اليوم التالي، قم بإجراء تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف للمادة الطافية من المزرعة الخالية من الخلايا والتي تم جمعها من الخلايا المنقولة بـ HCV RNA باستخدام وسط النمو، ثم قم بالتلقيح في ثلاث مكررات على خلايا Huh7.5.1. قم بتثبيت الخلايا بعد 72 ساعة من العدوى باستخدام الميثانول لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 °C. بعد إخراج الخلايا من المجمد، قم بإجراء صبغ مناعي لبروتين HCV NS5A باستخدام الظروف الموصوفة سابقاً. وباستخدام مجهر فلوري، قم بعد بؤر الخلايا الموجبة لـ NS5A في البئر الذي يحتوي على أعلى تخفيف فيروسي، واحسب متوسط عدد الوحدات المكونة للبؤر لكل ملليلتر.

تم تقييم جودة بلازميد HCV المخطّي بواسطة الفصل الكهربائي للهلام. خضع H-C-V-D-N-A لعملية نسخ في المختبر بوساطة T-seven RNA polymerase، مما أنتج منتج RNA واحد بطول 9.6 Kilobases. وأشارت نتائج RT-qPCR إلى أن الفيروس من النوع البري قام بتكرار الجينوم بكفاءة. وأظهر النوع البري مستوى من تكرار الجينوم أعلى بمقدار واحد إلى ثلاثة لوغاريتمات مقارنة بالفيروس الخالي من البوليميراز (pol-null).

أنتج الفيروس من النوع البري بروتين NS3 المشارك في شطر البروتين الفيروسي وتضاعف الجينوم. كما عبّر الفيروس من النوع البري عن بروتين NS5A، حيث تموضع بروتين NS5A والحمض النووي الريبوزي RNA ثنائي السلسلة في نفس الموقع داخل السيتوبلازم الخلوي للخلايا المنقولة من النوع البري، مما يشير إلى تضاعف فيروسي نشط. وأشارت قياسات عيار الفيروس إلى أن الفيروس من النوع البري معدٍ وينتج أكثر من 10,000 وحدة تشكيل بؤري لكل ملليلتر من الجسيمات المعدية. بعد ست ساعات من عملية النقل، أظهر كل من الفيروسات من النوع البري والفيروسات الخالية من البوليميراز (pol-null) أنشطة لوسيفيراز مماثلة، مما يشير إلى ترجمة مستوى مدخلات مماثل من الـ RNA المنقول. ومع ذلك، بعد 48 و96 ساعة من عملية النقل، أظهر الفيروس من النوع البري مستويات تضاعف جينومي متزايدة مقارنة بالفيروس الخالي من البوليميراز. كما أنتج الفيروس من النوع البري بروتين NS3 الفيروسي. وكان لدى الفيروس الخالي من البوليميراز مستوى أساسي من نشاط اللوسيفيراز، بينما سجل الفيروس من النوع البري مستوى تضاعف أعلى بمقدار لوغاريتمين إلى ثلاثة لوغاريتمات مقارنة بالفيروس المراسل الخالي من البوليميراز. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إجراء المقاييس الفيروسية لالتهاب الكبد C في غضون أسبوعين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم توفر خلايا قوية ونسخ RNA جينومية عالية الجودة من فيروس HCV. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن اختبار سلالات HCV الموصوفة في نظم نماذج حيوانية لبحث الكفاءة الحيوية في الجسم الحي والتفاعلات بين المضيف والممرض.

لقد مهد تطوير نظام زراعة خلوية معدٍ لفيروس التهاب الكبد C الطريق أمام الباحثين لاستكشاف خطوات تكوين الفيريون وخروج الفيروس في دورة تضاعف فيروس HCV. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحوصات فيروسية مختلفة لتوصيف المراحل المختلفة من دورة تضاعف فيروس التهاب الكبد C. لا تنسَ أن العمل مع فيروس التهاب الكبد C يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات الوقائية، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.