تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية

يتم تشغيل الدفاعات الفطرية ضد الالتهابات الفيروسية بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط أو PRRS. موجود في خلايا الجهاز المناعي الفطري أثناء العدوى. ترتبط العين PRRS السيتوبلازمية و PKR بتأكيد تغيير الحمض النووي الريبي للتوقيع الفيروسي ، وتأكيد جميع عيون الليجا وتنشيط الإشارات المضادة للفيروسات لمراقبة التغيرات التأكيدية في العين و PKR وجميع الأربطة في المختبر البشري A 5 49 خلية مصابة بفيروس حمى الوادي المتصدع.

استنساخ 13 لتحفيز تنشيط PRR. ثم يتم تحضير محللات الخلايا للتحكم والخلايا المصابة لتحليل التغيرات التأكيدية في العين وPKR. يتم إجراء هضم تجريبي محدود.

إذا حدثت تغييرات تأكيدية في بنية البروتين ، يكون البروتين أكثر مقاومة للهضم وسيتم رؤية العصابات مع النشاف الغربي ، يتم إجراء تحليل لتحليل تكوين الصفحة الأصلية للغاز متبوعا بتحليل النشاف الغربي. إذا حدثت جميع الأربطة أعلى ، رؤية جميع مجمعات عين جهاز الاختبار و PKR. الميزة الرئيسية لهضم البروتياز المحدود والصفحة الأصلية هي أن هذه التقنيات تسهل القياس المباشر لتنشيط الريغا و PKR.

يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة الفطرية ، مثل الطبيعة الدقيقة وأصل أنواع الحمض النووي الريبي ذات الصلة بتنشيط عين الحفارة و PKR. يمكن أن توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة على ناهضات العين وPKR. يمكن أيضا تطبيقها على بروتينات المستشعر السيتوبلازمية الأخرى مثل MDA five ، مما يدل على أن الإجراء سيكون ميلا فيفا ، طالبة دكتوراه من مختبري قبل البدء في هذا الإجراء.

يرجى ملاحظة أن استنساخ فيروس Rift Valley Fever 13 المشار إليه فيما يلي باسم CL 13 هو متحولة فيروسى موهن ، والتي يجب التعامل معها في ألمانيا بموجب شرطين BSL لتسخين وسط مصل PBS الخالي من التدفئة ووسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على 5٪ FCS. ضعها في حمام مائي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. تحضير 1.25 مرة 10 إلى السابع PFU لكل مليلتر من CL 13 في وسط خال من المصل ليصيب 2.5 مرة 10 إلى السادسة.

5 49 خلية ذات تعدد العدوى أو وزارة الداخلية من خمسة تستعد بنسبة 10٪ تقريبا أكثر مما هو مطلوب لحساب أخطاء سحب العينات. قم بإزالة الخلايا A 5 49 من الحاضنة ، واستنشق الوسط وأضف 10 مل من دوامة PBS أو قم بقلب قارورة الثقافة لغسل الخلايا ثم إزالة PBS. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من CL 13 المخفف أو للسيطرة غير المصابة أو العدوى الوهمية.

أضف ملليلتر واحد من الوسط الخالي من المصل واحتضنه لمدة ساعة واحدة كل 15 دقيقة. اقلب القارورة بعناية لضمان التوزيع المتساوي للوسط. بعد ساعة واحدة من الإصابة ، قم بإزالة اللقاح.

أضف خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الدافئة مع 5٪ FCS ، واحتضنه لمدة خمس ساعات. قم بإعداد PBS بنسبة 0.5٪ tritton X 100 وضعها على أربع درجات مئوية. لا تضيف مثبطات الإنزيم البروتيني السوري.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS البارد وأضف 10 مل من PBS الطازج. ثم باستخدام مكشطة الخلية ، افصل الخلايا عن الطبق. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 800 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 30 ميكرولتر من PBS مع 0.5٪ Triton X 100. انقل المحللة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل واحتضنه لمدة 10 دقائق على الأقل على الثلج. جهاز الطرد المركزي للمحللات عند 10 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، انقل محللة الخلية المصفاة إلى أنبوب جديد. قم بإجراء اختبار برادفورد لتحديد تركيز البروتين في محللة الخلية المصفاة ، وقم بتخزينه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو تابع على الفور لمحاولة الهضم أو الصفحة الأصلية لفحص التغييرات التأكيدية لمستقبلات التعرف على الأنماط أولا ، قم أولا بتخفيف L واحد من الكلورو أو معالج بكيتون الميثيل أو TPCK trypsin في PBS إلى تركيز عمل نهائي يبلغ ميكروغرامين لكل مليلتر في أنبوبين جديدين لكل حالة ، اضبط تركيز البروتين النهائي ل CL 13 وبروتين التحكم غير المصاب إلى 25 ميكروغراما في الحجم النهائي البالغ تسعة ميكرولتر مع PBS ، وسيتم استخدام مجموعة واحدة من المحللات كعنصر تحكم في المدخلات والأخرى سيتم معالجتها باستخدام TPCK trypsin إلى أنابيب التحكم غير المعالجة. أضف ميكرولتر واحد من PBS إلى الأنبوبين المتبقيين.

أضف ميكرولتر واحد من ميكروغرامين لكل ميكرولتر TPCK trypsin ليصل التركيز النهائي إلى 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر. امزج التفاعلات عن طريق سحب العينات. احتضان المحللات عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.

أوقف التفاعل بإضافة خمسة × عينة مؤقتة لتغيير طبيعة الطبيعة ثم الغليان لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية. من المهم عدم إطالة وقت حضانة التربسين. لاحظ أن التوقيت الدقيق لهضم التربسين أمر بالغ الأهمية للكشف عن الشظايا المقاومة دون أي خلفية إذا لم يتم اكتشاف البروتينات المقاومة أو إذا تم اكتشاف عدد كبير جدا ، فقد تم تعديل مدة الهضم. ذلك.

بعد الغليان ، قم بتخزين العينات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر أو قم بتحميل العينات على اثنين من كبريتات الصوديوم دوكال. جل بولي أكريلاميد يتكون من جل تكديس بنسبة 5٪ على جل قابل للحل بنسبة 12٪. افصل البروتينات عند 25 مللي أمبير لكل هلام حتى ينفد البرومو فينول الأزرق.

بعد تشغيل المواد الهلامية ، قم بنقل البروتينات من هلام واحد إلى غشاء فلوريد بولي كرمة وتحليلها بواسطة النشاف الغربي بالأجسام المضادة الموجهة ضد عين الحفارة وصمة عار PKR الجل الآخر مع kumasi الأزرق اللامع G two 50. ثم قم بتخزين الجل في 25٪ إيثانول و 8٪ حمض الأسيتيك و 4٪ جلسرين عند أربع درجات مئوية أو تابع إجراء التصوير والتحليل. لتحليل حالات قلة القلة لمستقبلات التعرف على الأنماط ، قم بإعداد 50 ميكروغراما من محللة الخلية في حجم نهائي قدره 10 ميكرولتر باستخدام PBS وأضف خمسة × عينة عازلة إلى تركيز نهائي قدره x واحد.

قم بتحميل العينات على الفور على جل بولي أكريلاميد أصلي مع تكديس 5٪ وهلام حل 8٪. سيؤدي أي تأخير إلى فقدان المجمعات الأصلية. قم بتشغيل الجل عند 20 مللي أمبير لكل هلام عند أربع درجات مئوية.

إيقاف الرحلان الكهربائي بعد 45 دقيقة من مغادرة الشريط الأزرق للفينول برومو للهلام بعد ما يقرب من 1.5 إلى ساعتين لكل إجراء النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد عين الحفارة و PKR كما هو موضح في الوثيقة المصاحبة لفحص التبديل التأكيدي والقلة الناجم عن التعرف على ناهض فيروسي بواسطة عين الحفارة أو PKR تم إجراء هضم البروتياز المحدود والصفحة الأصلية كما هو موضح في هذا الفيديو ، أدى هضم التربسين لمحللات الخلايا المصابة الوهمية إلى تدهور سريع في عين الحفارة ، بينما أدت عدوى Clone 13 إلى توليد جزء من عين الحفارة المقاومة 30 كيلودالتون. يظهر PKR أيضا مقاومة جزئية لهضم التريبسين في العينات المصابة ، والتي تتزامن مع فسفرتها لمراقبة كفاءة وخصوصية التريبسين تم تلطيخ المواد الهلامية الهضمية ب kumasi blue brilliant G two 50. تظهر العينات غير المعالجة كميات متساوية من البروتينات المحملة ، مما يؤدي إلى تعريض محللات خلية C 13 إلى هضم التريبسين إلى انخفاض مماثل في كميات البروتين العالمية.

هذا يدل على أن علاج التريبسين له نفس الكفاءة للعينات المصابة ب CL و CL 13 في الخلايا غير المصابة. تم الكشف عن مونومرات R EYE و PKR فقط كعنصر تحكم إضافي. تم تضمين عامل النسخ IRF ثلاثة ، وهو موجود كمونومر ، ولكن من المعروف أنه يتضعف عند التنشيط عبر R Eye.

عدوى الاستنساخ 13 إلى تراكم قوي لمجمعات قلة القلة في العين في شكل مسحة و PKR و IRF ثلاثة ثنائيات أو قلة كنطاق بروتيني محدد. توضح هذه النتائج أن الرحلات المحدودة في الهضم والصفحة الأصلية هي أدوات مفيدة لمراقبة التغيرات التأكيدية وتكوين oligo للعين الحديدية و PKR عند الإصابة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة تبديل تأكيد WIC العين و PKR وتحويله بمجرد إتقانه.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين بعد هذا الإجراء. كطرق مثل المقايسات الاحترافية يمكن إجراؤها من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان هناك تفاعل مستقر مع الترابط المحفز بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الفطرية لاستكشاف حالة تنشيط مستقبلات التعرف على الأنماط في الخلايا المحفزة الفيروسية.