عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من عينات المصل. باستخدام نسختنا المحسنة من بروتوكول RTLS المشترك لتجربة كاشف MRC. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخفيف المصل أولا بنسبة واحد إلى خمسة بالماء الخالي من النوكلياز لتقليل تلوث البروتين.

الخطوة الثانية هي إدخال أنبوبين من قفل الطور المليلتر لخطوة الطرد المركزي الأولى. هذا يحبس غالبية الملوثات ، مثل الفينول والبروتينات في المرحلة العضوية. بعد ذلك ، فإن خطوة التحسين الثالثة والأخيرة هي دوران الطرد المركزي الوميضي عند 12 ، 000 جبن ، والذي يزيل أي تلوث متبقي من حبيبات الحمض النووي الريبي قبل غسل الإيثانول.

تتمثل الخطوة الأخيرة في تجميع مستحضرين معدلين للحمض النووي الريبي من نفس المريض إذا كان هناك حاجة إلى إنتاجية إجمالية أعلى من الحمض النووي الريبي. في النهاية باستخدام هذه الطريقة المعدلة ، والتي يتم إذابة المصل في الماء الخالي من النوكلياز ، يستخدم أنبوب قفل الطور لاحتجاز الملوثات الرئيسية وإدخال دوران وميض. نوضح أنه من الممكن تعظيم استعادة الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المطلية من عزل الحمض النووي الريبي عن المصل.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي الثلاثي القياسي ، هي أنه من خلال التعديلات البسيطة ، يمكننا زيادة إنتاجية الحمض النووي الريبي من المصل. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الحمض النووي الريبي الصغير موجود بكميات منخفضة في المصل. ستعمل الطريقة المحسنة والتصور لهذه الخطوات على تحسين استعادة هذه الحمض النووي الريبي وتوجيه المبتدئين إلى نصيحة عزل ناجحة.

للبدء في إذابة عينة المصل المجمدة المعدة مسبقا على الثلج ، ثم انقل 400 ميكرولتر من المصل المذاب حديثا إلى أنبوب طرد مركزي صغير مسمى. بعد ذلك ، قم بتخفيف المصل ب 100 ميكرولتر من الماء الخالي من الأنف R وأضف 50 ميكرولتر من البروتيناز K بتركيز ملليغرام واحد لكل مليلتر. ثم احتضان المصل المخفف عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح بهضم البروتين الكافي لضمان الذوبان الكامل عند 1.5 مل من الكاشف الثلاثي RTLS و 100 ميكرولتر من أربعة أقول ترويجية.

اقلب المتجانسة لفترة وجيزة وقم بإجراء سحب ماصة متكرر لمدة خمس ثوان. ثم انقل الخليط إلى أنبوب قفل ذو طور ثقيل بسعة ملليلتر. قم بتدوير الجانس عند 12 ، 000 GS لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بصب ملليلتر واحد من المحلول المائي الناتج بعناية في أنبوب جديد منخفض ربط الحمض النووي. يجب أن تكون العضوية والواجهة محاصرة أسفل الجل الأبيض لأنبوب قفل الطور. ثم أضف خمسة ميكرولترات من الجليكوجين و 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ إلى المحلول المائي.

امزج المحلول عن طريق الانعكاس واحتضانه طوال الليل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد الحضانة الليلية ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 20 دقيقة عند 12،000 GS في جهاز طرد مركزي أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية الشفافة وقم بإجراء دوران سريع لمدة دقيقتين عند 16،000 GS في جهاز طرد مركزي أربع درجات مئوية.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة المحلول الشفاف المحيط بالحبيبات بعناية. ثم اغسل الحبيبات بملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول وقم بالطرد المركزي للعينة عند 10 ، 000 GS لمدة 10 دقائق. لتصور الحبيبات ، قم بإمالة الأنبوب أمام خلفية داكنة وقم بإزالة محلول الغسيل.

كرر الغسيل. تصعد. نعلق الحبيبات في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي.

تأكد من إذابة الحبيبات تماما عن طريق تسخين العينة عند 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. خلال هذا الوقت ، امزج العينة مع سحب العينات المتكرر للحصول على مجموعة إنتاجية إجمالية أعلى من الحمض النووي الريبي ، واثنين من مستحضرات الحمض النووي الريبي من نفس المريض. قم بقياس كمية الحمض النووي الريبي المعلق باستخدام مقياس الأشعة فوق البنفسجية مقابل

مقياس الطيف الضوئي وقم بتقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي 2100. ثم قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي المجمعة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في التطبيقات النهائية. توضح الملامح الضوئية الطيفية للحمض النووي الريبي من المصل البشري الإنتاجية المحسنة للحمض النووي الريبي بسبب إضافة عدة خطوات إلى نهج تشومسكي التقليدي.

يتناقض ملف تعريف الأشعة فوق البنفسجية النموذجي للحمض النووي الريبي المعزول من المصل البشري مع تلك التي تستخدم خطوات التحسين ، بما في ذلك إضافة الجليكوجين والدوران الإضافي ، وكل من هذه الأدوات مجتمعة مما أدى إلى تقليل الملوثات وزيادة إجمالي إنتاجية الحمض النووي الريبي. تم زيادة نقاء عينة الحمض النووي الريبي باستخدام هلام قفل الطور ، الذي يحبس الفينول والبروتينات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن زيادة حجم المصل له تأثير ملحوظ على محصول الحمض النووي الريبي.

تم إجراء تتبع محلل حيوي لتحليل جودة العينة بشكل أكبر. يمثل ارتفاع واحد عند حوالي 21 نيوكليوتيد توصيف مصفوفة جزء الحمض النووي الريبي الصغير وتم إجراء QPCR بعد الإجراء. يظهر ملف تعريف المصفوفة هذا لثلاثة سرطانات للرأس والرقبة و S طبيعي واحد تعبيرا عن microRNAs ، ويحلل باستخدام التجميع الهرمي ويتم تقديمه كخريطة حرارية حيث يمكن رؤية التنظيم الإضافي وتقليل تنظيم microRNAs.

تم إنشاء منحنيات تضخيم QPCR التالية ل microRNAs محددة. ثم تم استخدام هذه البيانات لرسم قيم التصوير المقطعي المحوسب الخام للمصل العادي بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية عبر أي عدد من المرضى الذين ينتجون الحمض النووي الريبي عالي الجودة بالحد الأقصى اليوم إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أو تسلسل الجيل التالي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل اكتشاف المؤشرات الحيوية والتحقق من صحتها.