الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد وحجم الحويصلات خارج الخلية باستخدام استشعار النبض المقاوم القابل للضبط. يتمثل النهج القياسي في مقارنة قياسات الحصار الحالية المأخوذة من الحويصلات خارج الخلية النقية مع تلك المأخوذة من معايير حبة البوليسترين. الطريقة الثانية لتوصيف الحويصلات خارج الخلية هي رفع العينة بخرز البوليسترين ، والذي يستخدم عند العمل مع عينات معقدة مثل الحويصلات خارج الخلية غير النقية.

في وسط زراعة الخلايا ، تميز البيانات الناتجة حجم وعدد الحويصلات خارج الخلية ، سواء كانت منقاة أو غير منقية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل النشاف الغربي أو قياس التدفق الخلوي للحويصلات خارج الخلية السابقة المرتبطة بخرز اللاتكس ، هي أن هذه الطريقة تميز الجسيمات مباشرة في السوائل البيولوجية دون الحاجة إلى عزل فيزيائي أو وضع العلامات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الحويصلات خارج الخلية غير متجانسة في الحجم.

عند محاولة اكتشاف الحويصلات الأصغر ، قد تسد الحويصلات الأكبر حجما المسام النانوية. لقد أضفنا بعض النصائح والحيل العملية إلى البروتوكول للعودة بسرعة إلى الظروف العملية. حاولنا تقليل إنتاج الحويصلات خارج الخلية واحتجنا إلى طرق لتحديد تركيز الحويصلات في زراعة الخلايا. سنت.

بحثا عن طرق لتوصيف جزيئات النانو ، صادفنا TRPS وقمنا بتعديل بروتوكولاتها لتكون أكثر ملاءمة لتوصيف الجزيئات وزراعة الخلايا. S طافية ، والسوائل البيولوجية الأخرى ابدأ بتوصيل أداة TRPS بجهاز كمبيوتر مع تثبيت برنامج مجموعة التحكم على العينين عليه. تأكد من تقليل التداخل الكهربائي كما هو موضح في بروتوكول النص.

الآن ، اختر حجم Nanopore. NP 100 هو الخيار الأفضل للحويصلات من 70 إلى 200 نانومتر ، بينما يمكن استخدام NP 150 لحويصلات بحجم 85 إلى 300 نانومتر. يعد NP 200 أكثر ملاءمة لقياس حويصلات من 100 إلى 400 نانومتر.

ثم حدد جزيئات معايرة البوليسترين التكميلية لجزيئات المعايرة NP 100 و NP 150 لتحديد جسيمات المعايرة CPC 100 ل NP 200. استخدم جسيمات المعايرة CPC 200. دوامة جزيئات المعايرة لمدة 30 ثانية.

إذا كانت لا تزال مجمعة ، فاستخدم الصوتنة ثم قم بتخفيف جزيئات المعايرة في PBS إلى التركيز المستهدف. بناء على حجم المسام النانوية ، يجب ألا يقل الحجم النهائي عن 40 ميكرولترا. الآن قم بترطيب خلية السائل السفلية للأداة عن طريق تطبيق 78 ميكرولتر من PBS وإزالتها على الفور.

هذا يقلل من خطر تكون الفقاعات تحت المسام النانوية. بعد ذلك ، ضع نانوبور في أذرع الأداة. قم بقياس المسافة بين الذراعين المتقابلين باستخدام الفرجار الرقمي.

أدخل هذه القيمة في البرنامج الموجود أسفل الحقل المسمى التمدد وبمجرد إدخاله ، انقر فوق معايرة التمدد باستخدام العجلة الجانبية التي تتحكم في المسافة بين الأذرع المتعارضة. قم بتمديد المسام النانوية إلى 47 ملم. بمجرد تمديده إلى الحجم ، أعد وضع 78 ميكرولترا من PBS على خلية السائل السفلية.

ابدأ عملية المعايرة بوضع خلية السائل العلوية على المسام النانوية وربط قفص التدريع. ثم أضف 40 ميكرولترا من جزيئات المعايرة المخففة إلى خلية السائل العلوي. الآن قم بتطبيق ما لا يقل عن 0.8 كيلو باسكال من الضغط الإيجابي.

باستخدام وحدة الضغط المتغير أو VPM ، حدد جهدا موجبا وانقر فوق تشغيل. ثم قلل ببطء من التمدد أثناء تحليل الحصار. الأحداث التي تسببها جزيئات المعايرة.

مع انخفاض التمدد ، سيزداد ارتفاع الحصار تدريجيا وبالتالي ستتحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء. يمكن أن تؤدي زيادة الجهد أيضا إلى زيادة ارتفاع الحصار ، ولكن يمكن أن تولد أيضا المزيد من ضوضاء RMS. توقف عن تقليل التمدد عندما تتجاوز الحواجز المرصودة مستويات الخلفية بشكل مناسب كما هو مذكور من لوحة تتبع الإشارة.

ثانيا ، راقب معدل الجسيمات. ومع ذلك ، فإن هذا له قطع أقل صرامة. يجب أن يكون معدل الجسيمات 100 في الدقيقة على الأقل.

ومع ذلك ، إذا كان معدل الجسيمات أكبر من 2000 في الدقيقة ، فقم بتخفيف العينة وإعادة معايرة الأداة. يمكن أن يؤدي هذا المعدل المرتفع إلى قياسات غير دقيقة لهذا العرض التوضيحي. تتميز الحويصلات خارج الخلية التي تم تنقيتها مسبقا من خط خلايا ورم الدماغ.

ابدأ بتحميل جزيئات المعايرة في مكبس خلية السوائل العلوي. قم بتشغيله ثم اضغط عليه باستخدام VPM وسجل ما لا يقل عن 500 جسيم من البيانات هنا. يتم تطبيق ضغط 0.8 كيلو باسكال.

اختياريا ، يمكن أيضا إجراء قياس متعدد الضغط للقيام بذلك ، وزيادة الضغط المطبق وتسجيل ملف معايرة ثان. يجب أن تكون زيادات الضغط 0.2 كيلو باسكال على الأقل الآن ، قم بإزالة العينة من الخلية العلوية وغسل الخلية ثلاث مرات ب 100 ميكرولتر من PBS لكل غسلة. بعد الغسيل، امسح خلية السائل العلوية بورق خال من النسالة.

أضف العينة التجريبية بعد ذلك. يجب أن يكون تيار خط الأساس في حدود 3٪ من التيار الذي لوحظ عند قياس جزيئات المعايرة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضغط على غطاء التدريع أو قم بلفه ، أو ضع المكبس أو قم بإزالة المسام النانوية تماما واغسلها بالماء.

إذا كان التيار المرصود جيدا ، فقم بتطبيق نفس الضغوط المطبقة على جزيئات المعايرة. ثم سجل 500 جسيم على الأقل واحفظ ملف البيانات. إذا كان هناك انقطاع مفاجئ في اكتشاف الجسيمات ، أو انخفاض في التيار الأساسي أو زيادة مفاجئة في ضوضاء RMS ، فقم بإيقاف التسجيل مؤقتا وحاول فك انسداد المسام النانوية.

كما كان من قبل ، قم بسحب العينة لأعلى ولأسفل. اضغط على غطاء التدريع أو لفه ، ضع المكبس أو قم بإزالة المسام النانوية تماما واغسلها بماء DI. تتمثل الإستراتيجية الأخرى في زيادة تمدد المسام النانوية حتى 47 ملم وتعظيم الضغط من VPM لمدة خمس دقائق تقريبا.

كما يمكن أن يقوم UNC أيضا بفصل NPO في البرنامج. انتقل إلى علامة التبويب تحليل البيانات وابدأ في معالجة البيانات بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق خيار الملفات غير المعالجة وحدد خيار معالجة الملفات. ثم لإقران ملفات العينة والمعايرة، انقر فوق خانة الاختيار بجوار العينة.

في العمود الذي تمت معايرته ، حدد الملفات المقابلة وموافق. الخيارات. سيعرض البرنامج خصائص عينة مختلفة مثل الحجم والتوزيع والمدد الأساسية والعرض الكامل ونصف الحد الأقصى وتحليلات التركيز.

يستخدم النهج التالي لعينات مثل السوائل البيولوجية التي تؤدي إلى الانسداد المفرط باستخدام الطريقة القياسية في التحضير ، وأجهزة الطرد المركزي لا تقل عن 50 ميكرولترا من زراعة الخلايا. طافي يحتوي على الحويصلات خارج الخلية لمدة سبع دقائق عند 300 Gs.قم أيضا بإعداد التحكم في الوسائط وحدها بنفس الطريقة لكل من العينة والتحكم انقل 20 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنابيب جديدة وأضف 20 ميكرولترا من PBS و 10 ميكرولترات من مخزون حبة البوليسترين المخفف 335 نانومتر بسعر 10 ملايين حبة لكل مليلتر.

الآن قم بإعداد الأداة كما كان من قبل ، باستخدام NP 200 Nanopore وقم بقياس عينة التحكم للخرز فقط في الوسائط. أولا ، من أجل الدقة ، يجب تقليل الكشف عن الخلفية للجزيئات الصغيرة غير الخرزية إلى أقل من 10٪ من اكتشافات الخرز. الآن ، قم بقياس كل عينة مرة واحدة قبل تسجيل التكرارات.

سيؤدي ذلك إلى توزيع ظروف المسام النانوية المتقلبة على العينات. يجب قياس كل عينة ثلاث مرات في النهاية عن طريق إعادة قياس عينة حبة المعايرة فقط. فيما بعد. أثناء تحليل البيانات ، استخدم برنامج جداول البيانات لإجراء حسابات التركيز.

يتم تضمين مثال على الحساب في البروتوكول المكتوب. تم تنقية الحويصلات خارج الخلية من U 87 M-G-E-G-F-R-V ثلاث خلايا ، طافية عن طريق الطرد المركزي الفائق ، ثم تم قياسها باستخدام البروتوكول الموصوف باستخدام حبات معايرة 115 نانومتر. تم الحصول على توزيع حجم الحويصلات خارج الخلية.

تم أيضا قياس الحويصلات خارج الخلية مباشرة من طاف ثقافة خلايا الورم الأرومي الدبقي ، باستخدام النهج البديل الذي يرفع العينة بمعيار. لوحظ مجموعتان من الجسيمات النانوية. حددت الحويصلات الأصغر خارج الخلية والمعيار المعروف الأكبر ، تقدير حجم المجموعتين بناء على المعيار المعروف ، مجموعة الحويصلات على أنها أكبر من 140 نانومتر.

ربما تم اكتشاف حويصلات أصغر خارج الخلية باستخدام فتحة نانوية أصغر ، ولكن كان من الممكن أن يكون هناك المزيد من الانسداد بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة إلى أربع ساعات اعتمادا على عدد العينات التي تم تحليلها. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن العينات قد تتطلب تعديلات الحاجز على البروتوكول.

على سبيل المثال ، قد تتطلب العينات المكونة من حويصلات أكبر استخدام مسام نانوية أكبر على امتداد كبير نسبيا ، ويمكن أيضا تسهيل القياسات عن طريق تصفية الطرد المركزي للعينات لإزالة الحطام الخلوي ، والذي يمكنه تسجيل المسام النانوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف الحويصلات خارج الخلية باستخدام TRPS. اعتمادا على عينة الحويصلة خارج الخلية ، يمكنك تطبيق البروتوكول القياسي أو استخدام طريقة الارتفاع المعدل.