A طريقة Permeabilization من ذبابة الفاكهة الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر

الهدف العام من التجربة التالية هو تحضير أجنة ذبابة الفاكهة قابلة للحياة مع قشر بيضة قابل للاختراق لاختبار النشاط الحيوي للأدوية الجزيئية الصغيرة أو السموم التي تم إدخالها. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الأجنة التي تم تنموها أولا باستخدام مبيض مخفف لإزالة طبقات قشر البيض المشيمية الخارجية. الخطوة الثانية هي إبراز الأجنة بمذيب يستنفد طبقة قشر البيض الشمعية الرقيقة التي تمنع المواد المذابة للجزيئات الصغيرة.

الخطوة الثالثة هي معالجة الأجنة بدواء أو سم وصبغة لقياس نفاذية قشر البيض في نفس الوقت وإدخال مركب مثير للاهتمام. بعد مزيد من التطوير ، يمكن تصوير الأجنة مباشرة أو معالجتها من أجل الكيمياء المناعية. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج نشاط الدواء أو السم على نمو الأنسجة على النحو الذي يحدده الفحص المجهري الفلوري مع الكواشف المناعية أو الروابط الحيوية.

سأقدم اليوم طريقتنا في تغلغل أجنة ذبابة الفاكهة لمقايسات نشاط الجزيئات الصغيرة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل استخدام المذيبات العضوية التقليدية مثل الهبتان إلى التجحيم. قشر البيض هو أن مذيب نفاذية الجنين لدينا ، أو EPS قابل للتفويت بالماء وغير سام نسبيا.

تسهل هذه الخصائص علاجات الأجنة حيث يمكن التحكم في التعرض للمذيبات بشكل أكثر دقة ويمكن إجراؤه في وسائط ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، وكلاهما يؤدي إلى زيادة قابلية الجنين للبقاء. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما فكرت في كيفية إزالة الطبقة الشمعية من قشرة البيضة. كوني متزلجا ، فكرت في الاستخدام الشائع لمذيبات الحمضيات لإزالة الشمع المتبقي من قاعدة الزلاجات.

دفعني هذا إلى ترجمة هذا التطبيق إلى قشر بيضة جنين الذبابة ، وبعد بعض التجارب والخطأ أدى إلى حل تكوين EPS ، قم بإعداد أقفاص سكانية بها ما لا يقل عن 500 ذباب في عمر التزاوج من السلالات المرغوبة. يجب أن تكون الأقفاص مناسبة لعصير العنب 10 سم. تهوية مع القليل من معجون الخميرة.

قم بتغيير هذه الأطباق مرتين في اليوم. بعد بضعة أيام ، سيتم تكييف الذباب بالثقافة ووضع الأجنة بشكل أكثر انتظاما. EPS مصنوع من المواد الخافضة للتوتر السطحي ومحاليل المذيبات المحددة وهو جيد لمدة شهرين.

عند تخزينها في درجة حرارة الغرفة ، قم بتسخين المواد الخافضة للتوتر السطحي إلى 37 درجة مئوية عند خلط EPS الطازج لعلاج EPS ، يتم التعامل مع الأجنة بسلال مصنوعة من ثلاثة سنتيمترات ، لذلك 50 مليلتر من البولي بروبيلين وشبكة النايلون خشنة. تذوب الحواف البلاستيكية في الشبكة بسهولة أكبر أثناء خطوات التطوير اللاحقة. يتم التعامل مع الأجنة أيضا بسلال مصنوعة من أغطية أنابيب سعة 50 ملليلترا.

يتم حفر الغطاء وإحرازه ، ويؤمن الخيوط بين الغطاء والأنبوب الشبكة. بدلا من ذلك ، يتم استخدام غرفة منزلقة محلية وتحضيرها بقطعة من الأكسجين النفاذة. قم بتأمين الغشاء فوق الفتحة بواسطة حلقة التجنيب لحصاد الأجنة.

ضع طبق عنب طازج مع معجون الخميرة على المزرعة في الصباح. بعد ساعة ، قم بتغيير اللوحة وتخلص من اللوحة الأولى التي تم جمعها. دع الصفيحة الثانية تجمع الأجنة لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية.

ثم اجمع اللوحة وانقلها إلى 18 درجة مئوية. اسمح للأجنة بالتطور إلى المرحلة المرغوبة. عندما تكون الأجنة جاهزة ، قم بتغطيتها قبل علاج EPS.

اشطفها من الطبق في سلة الهريس بالماء واستخدام فرشاة الرسم. ثانيا ، اشطفها بالماء الجاري اللطيف لإزالة أي حطام. ثالثا ، اغمرهم في مبيض بنسبة 50٪ لمدة دقيقتين مع الدوران الدوري لمحلول التبييض.

ثم اشطفها على الفور بالماء الجاري. الآن املأ ستة أطباق بحجم 60 ملم لكل منها 10 ملليلتر من PBS لتعمل كحمامات وقم بعمل تخفيف واحد إلى 40 من مخزون EPS في MBIM ، قم بتدوير المزيج. سيشكل مستحلب أبيض لطخة الماء الزائد من قاع السلة الشبكية باستخدام منديل واغمر الأجنة في تخفيف EPS بحركة دوامة مستمرة.

بعد تحريك الأجنة في EPS لمدة 30 ثانية ، قم بإزالتها ومسح المحلول الزائد. ثم حرك السلة بين حمامات PBS الستة ، مع رشها برفق لشطفها والمضي قدما في العلاج بالصبغة والأدوية. يعد تحسين النفاذية والجدوى الجزء الوحيد الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول.

النفاذية حساسة لمرحلة نمو الجنين. درجة الحرارة التي تتقدم فيها الأجنة في العمر ويمكن أن تختلف أيضا بشكل كبير بين سلالات الذباب الفردية. يجب الوصول إلى أفضل المعلمات لتخفيف EPS ووقت التعرض تجريبيا.

أولا ، قم بإعداد محلول 50 ميكرومولار من صبغة حمض الكربوكسيل الخيال العلمي في M-B-I-M-T يكفي ملليلتر واحد في أنبوب ميكروفيش. يمكن إضافة مادة سامة أو دواء في هذه المرحلة لخلط دوامة العلاجات الحادة. انقل أجنة البيرم من السلة إلى أنبوب fuge الصغير باستخدام فرشاة الرسم.

قم بتغطية الأنبوب وقلبه عدة مرات. ثم قم بتحميل الأنبوب على مطفر واتركه يحتضن لمدة 15 دقيقة. بعد أن تستقر الأجنة ، قم بإزالة الصبغة بماصة وأضف ملليلترا واحدا من M-B-I-M-T للغسيل. ريسوس.

قم بتعليق الأجنة ، واتركها تستقر وتستبدل M-B-I-M-T. ثم افعل ذلك للمرة الثالثة والرابعة. بمجرد اكتمال الرابعة ، قم بإزالة كل M-B-I-M-T وانقل الأجنة إلى سلة نمو لفترات نمو طويلة.

بالنسبة لسلة التطوير أولا ، قم بإعداد السلة بشطف 70٪ من الإيثانول ثم يجفف الماء بالدم بمسح معملي. عند الانتهاء. بعد ذلك ، انقل السلة إلى طبق 60 ملم به ستة ملليلتر من وسط الحضانة الذي يحتوي على الدواء أو السم المطلوب.

انقل الأجنة إلى الشبكة الموجودة في السلة بفرشاة طلاء عن طريق إسقاط وسط الحضانة فوقها برفق ، وقم بتفريق الأجنة في طبقة أحادية. احرص على عدم حبس فقاعات الهواء تحت الشبكة. لاستخدام غرفة الشريحة أولا ، قم بإعداد الغرفة ، وقلب غرفة الشريحة ووضع حبة رقيقة من الشحوم المفرغة حول حافة الفتحة.

التحميل التالي ، 150 ميكرولتر من الوسط المطلوب على سطح غشاء do داخل الفتحة. الآن ، انقل الأجنة إلى الوسائط باستخدام فرشاة الرسم وقم بتفريقها فوق الغشاء. قم بإنهاء ذلك بتطبيق زلة غطاء دائرية مقاس 25 ملم لتسطيح الوسط.

ضع ضغطا خفيفا حول المحيط لضمان الختم. هناك تأثير قوي لتربية الأجنة عند 18 درجة مئوية على قدرتها على أن تكون perme بواسطة EPS وامتصاص الصبغة في المراحل المتأخرة من التطور. يتضح ذلك من خلال عدم امتصاص Rumine BD في الأجنة المعالجة EPS التي يتم رفعها عند 25 درجة مئوية ، ويكشف امتصاص صبغة حمض الكربوكسيل الخيال العلمي التي تظهر هنا باللون الأحمر عن المستويات المختلفة من النفاذية التي تظهر عادة في الأجنة المعالجة EPS.

يكشف التوزيع الديناميكي لصبغة الخيال العلمي الحمراء البعيدة أثناء التطور ، وتوحيدها في صفار البيض داخل القناة الهضمية المطورة التي شوهدت مع التألق الذاتي الأزرق عن معيار يستخدم لتقييم الجدوى. يمكن لصبغة الخيال العلمي أيضا تحديد نفاذية الجنين السابقة بعد تثبيت الفورمالديهايد والتلوين المناعي. بعد معالجة أجنة EPS بصبغة الخيال العلمي وسم ميثيل الزئبق ، يتم تلطيخها بأنتيفا اثنان باللون الأخضر لتسمية الخلايا العصبية الحركية ومختبر مكافحة E باللون الأحمر لتسمية أجسام الخلايا العصبية.

صبغة الخيال العلمي ملونة زائفة باللون الأزرق. ميثيل الزئبق له تأثير على زخرفة أجسام الخلايا العصبية الكورتونية التي تتميز بالسهام في أجنة العلاج الضابطة. تحتوي هذه الخلايا العصبية على لفافة أكثر تنظيما ، وهما مثالان هنا باللون الأبيض ، مما يوضح التفرع الطبيعي للخلايا العصبية القطاعية في علاج التحكم الذي لاحظته رؤوس الأسهم.

وبالمقارنة، فإن معالجة ميثيل الزئبق تغير نمط التفرع كما هو موضح بالسهام الخضراء الصلبة. يشير السهم الأخضر المجوف إلى مكان تهجير المتفرعين. بمجرد إتقان علاجات نفاذية الأجنة في هذه التقنية يمكن إجراؤها في حوالي 30 أو 40 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التثبيت والتلوين المناعي للأجنة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الأنسجة المحددة التي يستهدفها الدواء أو السم أثناء التطور. أشكركم على مشاهدة هذا الإجراء وأتمنى لكم حظا سعيدا في وضع هذه الأساليب في مختبركم.