تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم تكوين جزء النيفرون ووظائفه في كلية أسماك الحمار الوحشي البالغة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن الدكسترين المسمى بالفلورسنت أولا في عش يربط أسماك الحمار الوحشي. الخطوة الثانية هي إزالة الكلى وإصلاحها لإعداد الأنسجة لطرق وضع العلامات اللاحقة.

بعد ذلك ، يتم تبييض الكلى لإزالة التصبغ ثم تلطيخها بعلامات الفلورسنت على أجزاء النيفرون المرغوبة. يتم الحصول على النتائج باستخدام التألق المناعي والفحص المجهري و / أو التصوير الميداني الساطع الذي يتيح تصور تشريح الكلى بناء على البقعة أو البقع المحددة. يمكن أن تساعد طرق وضع العلامات التالية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكلى فيما يتعلق بتشريح الأعضاء ويمكن استخدامها لدراسة تكوين النيفرون وتقييم وظائف الكلى قبل وبعد حدث الإصابة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنيات إلى دراسة التشوهات الجينية في تكوين الكلى البالغة ويمكن أيضا تطبيقها لتقييم الحالة الكلوية أثناء نمذجة الأمراض المزمنة. للبدء صب المحلول من سمكة مخدرة ووضع بعناية على الجانب البطني العفن الإسفنج الرطب. بعد ذلك ، املأ حقنة الأنسولين ب 20 ميكرولترا من محلول مخزون الدكسترين المذاب.

ضع الإبرة بحيث يحدث الإدخال بزاوية ضحلة عند خط الوسط البطني للبطن. لتجنب حقن الأعضاء قليلا ، ارفع الإبرة بعد الحقن مباشرة لرفع جدار الجسم وخلق مساحة لحقن المحلول. بعد الحقن ، أعد السمكة برفق إلى الخزان للتعافي من التخدير.

للبدء ، قم بالتخلص من أي محلول إضافي من سمكة مخدرة وضعها على منديل أو منشفة ورقية. بعد إزالة الرأس والأعضاء الداخلية ، استخدم إبر تشريح فائقة الدقة لفتح جدران الجسم. حدد موقع عضو الكلى الملتصق بالجدار الظهري للحيوان.

استخدم ملقطا دقيقا لفصل الكلية عن الجدار الظهري. ضع الكلية برفق في قارورة زجاجية سعة خمسة ملليلتر تحتوي على XPBS واحد واغسلها ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. قم بإزالة الكلية بماصة نقل وضعها على شريحة زجاجية نظيفة مع قطرة إلى قطرتين من XPBS واحد.

استخدم ملقطا دقيقا لتسطيح الكلى على الشريحة ، مع التأكد من عدم تجعد أي نسيج أو انقلبت على نفسها. يمكن استخدام أداة سلك التنغستن لعمل شقوق صغيرة في النسيج الضام لتسهيل وضع الكلى بشكل مسطح. بعد ذلك ، ضع قطعا صغيرة من طين النمذجة على كل ركن من زلة غطاء زجاجي مقاس 18 × 18 ملم.

اضبط زلة الغطاء ببطء على الكلى ، مع الحفاظ على زاوية طفيفة. لتقليل فقاعات الهواء المحبوسة، أضف قطرة إضافية من XPBS لملء الفراغ بين انزلاق الغطاء والانزلاق إذا لزم الأمر. يتم القتل الرحيم لمجموعة منفصلة من أسماك الزرد ونقعها في مثبت طوال الليل.

عندما تصبح جاهزا ، استخدم ملقطا دقيقا لفصل الكلية بعناية عن جدار الجسم الظهري ووضع العضو في قارورة زجاجية. اغسل الكلية المقطعة ثلاث مرات بثلاثة إلى خمسة ملليلتر من XPBS واحد مع 0.05٪ من المراهقين لمدة خمس دقائق لكل منهما. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول PBS وشطف الكلى بثلاثة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة.

بعد هذا الوقت ، استبدل المحلول بثلاثة ملليلتر من 30٪ سكروز واحفظه طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. قم بإزالة المحلول وغسل الكلى مرتين قبل إضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من محلول التبييض. لإزالة تصبغ الخلايا الصباغية الموجود على عضو الكلى ، ضع القارورة الزجاجية على دوار وراقب بعناية اختفاء التصبغ.

إزالة التصبغ عادة حوالي 20 دقيقة ، ولكن في بعض الأحيان قد يستغرق ما يصل إلى 60 دقيقة. إذا ترك محلول التبييض لفترة طويلة جدا ، فقد يحدث التفكك ، وبالتالي ينصح بمراقبة العينة كل 10 إلى 15 دقيقة للتحقق من سلامتها عند إزالة التصبغ من غسل الكلى مرتين واحتضانه بمحلول 4٪ PFA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول 4٪ PFA واغسل الكلى ثلاث مرات بعد الغسيل الأخير بمعدل ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من محلول الحجب واحتضان الكلى في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

عند اكتمال الحجب ، انتقل مباشرة إلى بروتوكول التلوين المحدد. قم بإزالة محلول الانسداد واغسل الكلى ثلاث مرات قبل ترك الكلى تنقع في XPBS لمدة 10 دقائق على الأقل. خلال هذا الوقت ، انقل الكلية إلى طبق ثقافة 12 بئر أو 24 بئر.

استبدل XPBS بمحلول ركيزة الفوسفاتيز القلوي الكافي لتغطية العينة ووضع العينة على دوار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا الوقت ، أوقف التفاعل عن طريق غسل الكلى بمحلول عازلة للغسيل بالفوسفاتيز القلوي. اشطف الكلى بثلاثة تغييرات من محلول الغسيل المؤقت على مدار 10 إلى 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الغسيل العازل وتركيب الكلى على كوب نظيف. حرك وسط تركيب الفوسفاتيز المضمن في مجموعة الملصقات. تصور الكلى الملطخة بالفوسفاتيز القلوي باستخدام مجهر استريو أو مجهر مركب مع مجموعة مرشحات دبي.

أولا ، قم بإعداد حل DBA يعمل بسعة 200 ميكرولتر عن طريق تخفيف DBA في XPBS واحد. استبدل محلول PBS ب 200 ميكرولتر من محلول DBA وضع العينة على محور دوار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا الوقت ، قم بإزالة محلول DBA واغسل الكلى ثلاث مرات بثلاثة إلى خمسة ملليلتر من XPBS لمدة خمس دقائق لكل منهما.

قم بإزالة XPBS وقم بتركيب الكلية على شريحة زجاجية نظيفة. كما هو موضح سابقا ، تخيل الأجزاء البعيدة الملطخة ب DBA من الكلى باستخدام مرشح Trixie أو Texas الأحمر القياسي المثبت على مجهر ستيريو فلوري أو مجهر مركب. في هذه الصورة الساطعة لكلية غير مبيضة ، يتوافق التصبغ الأسود مع السكان المتناثرين من الخلايا الصباغية.

هنا يتم تصور قطاعات التخلصات من الكليفون بعد ثلاثة أيام من حقن الدكسترين. يحتوي الجزء الداخلي على صورة لنيفرون واحد مصاب بالخلايا الصباغية. تظهر هذه الصورة كلية بالغة بعد إزالة تصبغ الخلايا الصباغية.

تصور هذه الصور التمثيلية اختلافات مورفولوجية طفيفة بين أجزاء معاهدة التعاون بشأن البراءات ، في حين أن العديد من PCTs للنفرون ملفوفة بإحكام. تحتوي النيفرون الأخرى على مناطق معاهدة التعاون بشأن البراءات التي تحتوي على الحد الأدنى من التفاف دكسكترين الشلال الأزرق ، ولوسيفر الأصفر ، ودكسترين فلورو روبي ، وكلها تصنف بشكل تفضيلي شرائح معاهدة التعاون بشأن البراءات في النيفرون الكلوي ، ويظهر كل من الدكسترين Cascade Blue و Lucifer Yellow بعض الملصقات غير المحددة مع خلفية أعلى بكثير لوحظت في الكلى المعالجة باللون الأصفر لوسيفر. في المقابل ، أظهر دكسترين فلورو روبي خلفية منخفضة بشكل كبير مع وضع العلامات المكثفة على معاهدة التعاون بشأن البراءات.

تظهر الكلى البالغة الملطخة بالرغبة في اكتشاف علامة محددة من نوع الخلية الناقل لمعاهدة التعاون بشأن البراءات خاصية نمط التعبير لامتصاص الدكسترين مع توزيع مختلف مجالات معاهدة التعاون بشأن البراءات الملفوفة بإحكام ، بالإضافة إلى امتدادات أكثر إطالة لمعاهدة التعاون بشأن البراءات تظهر قطرا عريضا ثابتا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية شرائح النيفرون بنجاح داخل كلية الزرد البالغة ، مثل النبيبات القريبة مع الفوسفاتيز القلوي والنبيبات البعيدة الطبية مع DBA. لا تنس أن العمل مع 4٪ بارالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء المعطف والقفازات والنظارات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.