وهناك طريقة جديدة لتوضيح تصور الصفراوية الكبد الصفراء خلال التحول في البحر الجلكى ( Petromyzon مارينوس)

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الكبد بأكمله والتقاطع مع الأمعاء من أجل التحليلات العالمية والهيكلية والخلوية للتنكس الصفراوي. في لامبري C المتحول. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت الأنسجة أولا في محلول مونومر الهيدروجيل.

بعد ذلك ، يتم بلمرة الهيدروجيل بالأنسجة الثابتة. ثم تتم إزالة غشاء البلازما للأنسجة الثابتة ويصبح النسيج شفافا. أخيرا ، يتم إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي في نهاية المطاف بالليزر للجلد ويستخدم الفحص المجهري متحد البؤر لإظهار التغيرات الهيكلية والخلوية العالمية أثناء التنكس الصفراوي في لامبري المتحول.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الطبي الحيوي ، مثل العصبية في الجهاز العصبي المركزي ، وفي حالتنا ، التنكس الصفراوي أثناء تحول نقطة المصل. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص القناة الصفراوية البشرية أو رتق المرض لأن مرض الرضيع الخلقي النادر هذا يشترك في خصائص متشابهة مع التنكس أثناء تحول نقطة المصل. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وجدنا مقالا إخباريا في Nature وقدمنا الفيديو عبر الإنترنت خلال اجتماع المختبر الخاص بنا يوضح أن الإجراء سيكون آن سكوت ، طالبة دراسات عليا من مختبرنا بعد صنع محلول ملحي مخزن للفوسفات ومحلول ملحي أو pb ، وفقا لبروتوكول النص.

في غطاء الدخان ، قم بإعداد 400 مل من الهيدروجيل عن طريق الجمع بين الماء المقطر ، 40٪ أكريلاميد 2٪ مكرر أكريلاميد 10 XPBS ، 16٪ بارافورم ، ألدهيد ، صابونين ، والأمونيوم لكل كبريتات. قم بإعداد لتر واحد من محلول المقاصة المكون من 4٪ SDS و 0.2 حمض البوريك المولي ، وصنع 500 مل من 80٪ من الجلسرين لتحضير الأنسجة في غطاء الدخان. Eloqua 10 مل من محلول مونومر الهيدروجيل في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل.

قم بتشريح عينة الأنسجة ووضع الأنسجة في كل أنبوب من الهيدروجيل عند أربع درجات مئوية لمدة يومين. بعد الحضانة تحت غطاء الدخان ، قم ببلمرة الأنسجة الثابتة بإضافة خمسة ميكرولترات من التيميد. ثم تخلط جيدا وتترك العينات تحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الجل الزائد جيدا لمسح عينات الأنسجة. ضع كل منها في 15 مل من محلول المقاصة واحتضنه عند 50 درجة مئوية و 70 دورة في الدقيقة لعدة أيام حتى تصبح شفافة. قم بتغيير محلول المقاصة مرة واحدة على الأقل يوميا وقم بإزالة أي هلام زائد.

انقل العينات في 15 مل من 0.1 مولي PB مع 0.1٪ Triton X 100 عند 37 درجة مئوية و 70 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. كرر الحضانة مرتين أخريين باستخدام مخزن مؤقت جديد. الآن بعد أن تم تنظيف الأنسجة وخالية من أي هلام زائد ، اغمر العينات في الجسم المضاد الأولي في PB tritton X 100 واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 70 دورة في الدقيقة لمدة يومين بعد الحضانة ، استخدم 15 مل من PB مع 0.1٪ tritton X 100 لغسل عينات الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 70 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.

كرر الغسيل ثلاث مرات بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل النهائي ، أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في PB مع 0.1٪ Trix 100 وحجب المصل واحتضانه في الظلام عند 37 درجة مئوية و 70 دورة في الدقيقة ليوم واحد. بعد غسل العينات ثلاث مرات في 10 ملليلتر من PB tritton X 100 عند 37 درجة مئوية و 70 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها ، قم بإجراء ثلاث غسلات ليلية في PBS. أخيرا ، احتضان الأنسجة المصفاة في 80٪ من الجلسرين ، مغطاة بورق الألمنيوم طوال الليل.

ثم يتم إجراء التصوير المجهري متحد البؤر في الضوء المظلم أو الخافت ، على الرغم من أن الأضواء مضاءة في هذا الفيديو لأغراض التصور. تحدث العديد من الأحداث التنموية المهمة في الجهاز الصفراوي HEPA أثناء التحول c lampre ، على سبيل المثال ، كما هو موضح هنا ، تخضع القناة الصفراوية والمرارة لموت الخلايا المبرمج وتتدهور. بعد استخدام طريقة التوضيح المعدلة والتلوين باستخدام علامة خلية الكبد السيتوكيراتين 19 المضادة لعلامة موت الخلايا المبرمج ، تم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر BCL لإجراء التقسيم البصري من خلال الكبد السليم.

كشف التلوين أن العملية التنكسية تحدث في مراحل التحول من الثانية إلى الرابعة. الألواح العلوية من الأمام والألواح السفلية من الطرف الخلفي. تظهر هنا الشجرة الصفراوية وهنا خلايا موت الخلايا المبرمج ذات المظهر الشجيري الداكن وأدوات القنوات والقنوات المحيطة في الكبد.

يمثل هذا الشكل صورا ثلاثية الأبعاد أعيد بناء سلسلة Z متحدة البؤر لثلاثة كبد بين المرحلتين المتحولة الثانية والثالثة المسمى بأجسام مضادة ضد السيتوكيراتين 19 و BCL الثاني ، والشجرة الصفراوية والخلايا المبرمج ذات المظهر المتغصن الداكن وأدوات القنوات المحيطة بها تتميز بسهمين أبيض وأسود على التوالي. يظهر هنا قسم بصري متحد البؤر من القنوات الصفراوية لعينة بين المرحلتين المتحولة الثانية والثالثة مع قطرات صفراوية في التجويف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توضيح الأنسجة بأكملها لمزيد من تحليلات التصوير.

لا تنس أن العمل مع محاليل بارافورم وألدهيد وبولي أكريلاميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات واستخدام غطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.