عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية
سبتمبر 23, 2014
تم إعاقة تحليل تعبير البروتين في صمامات الفأر الجنينية الصغيرة بسبب الأنسجة المحدودة المتاحة. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لإعداد البروتين من تطوير مناطق صمام الفأر الجنيني لتحليل اللطخة الغربية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل واستخراج البروتين من صمامات القلب الجنينية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الجنين أولا عن الفأر الحامل. في الخطوة الثانية ، يتم تشريح القلب من الجنين ، ثم يتم جمع صمامات القلب في الخطوة الأخيرة.
يتم تحلل الأنسجة ويتم تحضير عينة البروتين الناتجة للتحليل اللاحق. في النهاية ، يمكن استخدام تحليل BLO الغربي لتقييم مستويات التعبير عن البروتين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التشريح بسبب الشكل المضغوط الصغير للقلب النامي.
في اليوم الجنيني المطلوب من التطور ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم بطن الأنثى الحامل. ثم ارفع جلد وعضلات أسفل البطن لأعلى وبعيدا عن الأعضاء الداخلية ، وقم بتشريح تجويف أسفل البطن للسماح بالوصول إلى قرن الرحم. بعد ذلك ، أمسك عنق الرحم بالملقط وقم بقص التدليل بعناية على الأطراف.
ثم ارفع قرن الرحم لقطع أي نسيج ضام يحافظ على القرن في مكانه ، واستكمل الإزالة عن طريق قطع تقاطع قرن الرحم مع uct. ضعي قرن الرحم المقطوع في طبق بتري يحتوي على عازلة باردة 0.1 مولار وشطفها حسب الحاجة. ثم قطع قرن الرحم.
افتح بالطول لكشف الأكياس الجنينية. لفضح الجنين ، افتح كيسا جنينيا عند تقاطع المشيمة والجنين ، واقطع الأوعية السرية لتحرير الجنين. ضع الجنين المقطوع في طبق بتري ثان مع محلول بارد 0.1 مولار ، وأعد طبق بتري الأول مع الأجنة المتبقية التي تم تشريحها إلى الجليد حتى التشريح الجنيني التالي.
بعد قطع الرأس ، ضع الجنين على ظهره واقطع جدار الصدر عموديا على طول جانب القفص الصدري بالقرب من العرج وأفقيا فوق الحجاب الحاجز. لتصور القلب ، افتح جدار الصدر. ثم امسك الملقط عاليا على طول الأوعية الكبيرة ، وارفع القلب واقطع الأوعية أدناه.
بعد ذلك ، قم بقص فوق الملقط لتحرير القلب. إذا ظلت الأوعية الرئوية غير مقطوعة ، فقم بإزالة الرئتين بالقلب قبل الاستمرار في المراحل الجنينية الموضحة هنا ، يكون الشريان الرئوي معتما قليلا. بعد تحديد الشريان ، قم بقصه وإزالته فوق مستوى الصمام.
الآن ، قم بقص أسفل الصمام الرئوي مباشرة ، وتجنب عضلة القلب البطينية في مرحلة الطفولة المبكرة ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد بعيدا عن منطقة الاهتمام. قبل وضع الصمام في أنبوب einor يحتوي على ميكرولترين من محلول التحلل مثل الشريان الرئوي ، سيبدو الشريان الأورطي معتما قليلا. بعد تحديده ، قم بقص أسفل الصمام الأبهري مباشرة.
مرة أخرى ، تجنب عضلة القلب البطينية المربقة. قم بإزالة أي محلول ثلاثي زائد ، ثم انقل الصمام إلى أنبوب einor الذي يحتوي على التحلل والمخزن المؤقت وأنسجة الشريان الرئوي. بعد جمع كل الأنسجة ، ضع العينات على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى أبعد من ذلك.
استخدمه لاستخراج البروتين ، وقم بإذابة الأنسجة المجمعة على الجليد ، ثم قم بتقطيع العينات لمدة دقيقة واحدة عند 13 ، 100 جي عند أربع درجات مئوية. تحقق من حجم العينة الناتجة واستخدم مخزن التحلل ليصل الحجم الإجمالي إلى 40 ميكرولترا. ثم أضف حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ بخمسة ملليمترات لتعطيل العينات وتجانسها في lyr لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق عند 50 هرتز ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
بعد التجانس ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة ونقل العينات إلى أنابيب جديدة ، تاركا وراءها الحطام غير القابل للذوبان لمزيد من التحليل التجريبي. باستخدام تقنية التحضير هذه ، يمكن اكتشاف smad الفسفوري 1 5 8 في مناطق الصمام الأبهري الفردي من أجنة E 13.5. على سبيل المثال ، البروتين المعزول حتى من منطقة صمام واحدة كاف للكشف عن نطاق p smad باهت مع زيادة شدة الإشارة بشكل متناسب مع عدد مناطق الصمامات المجمعة.
الأهم من ذلك ، أن نسبة الأكتين p smad beta تظل ثابتة بوضوح عبر أحجام العينات المختلفة نظرا لانخفاض مستويات البروتين المتاحة ، ولا يمكن تجريد نفس اللطخة وإعادة فحصها بحثا عن إجمالي smad. ومع ذلك ، فإن بقعة منفصلة تظهر إجمالي smad one و beta actin تظهر نفس نمط التعبير. تخلو مناطق الصمامات هذه بالكامل تقريبا من تلوث عضلة القلب البطينية باستخدام تقنية التحضير هذه بالاشتراك مع عينات من البطين الأيمن ، وعلامة عضلة القلب البطينية ، ولا يمكن اكتشاف NP في مناطق الصمام الأبهري ، بينما يتم اكتشاف هذه العلامة بسهولة في البطين.
علاوة على ذلك ، يمكن أيضا اكتشاف سلسلة ضوء الميوسين الخفيفة لعلامة عضلة القلب البطينية Two V بسهولة في العينة البطينية ، ولكن بالكاد يمكن اكتشافها في مناطق الصمام الأبهري مما يؤكد دقة التسلخ بعد هذا التشريح. يمكن إجراء mes أخرى مثل QPCR أو RN AIC من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات النهائية التي تتأثر خلال خطوات النمو المختلفة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لعزل واستخلاص البروتين من الصمامات القلبية الجنينية في الفئران. وتعالج هذه الطريقة التحديات المتعلقة بتحليل التعبير البروتيني الناتجة عن محدودية توفر الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- أبحاث القلب والأوعية الدموية
خلفية علمية
- غالباً ما يكون تحليل التعبير البروتيني في الأنسجة الجنينية محدوداً بحجم العينة.
- يعد فهم مستويات البروتين في الصمامات القلبية أمراً بالغ الأهمية للدراسات التنموية.
- يعتبر تحليل Western blot تقنية شائعة لتقييم التعبير البروتيني.
- يمكن أن يكون تشريح الأنسجة الصغيرة مثل القلوب الجنينية تحدياً من الناحية التقنية.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل لاستخلاص البروتين من صمامات قلب الجنين للفأر.
- تسهيل تحليل western blot لدراسة مستويات التعبير البروتيني.
- تعزيز القابلية للتكرار والدقة في تحليل البروتين من العينات المحدودة.
الطرق المستخدمة
- عزل الأجنة من الفئران الحوامل.
- تشريح القلب من الجنين.
- جمع صمامات القلب لاستخلاص البروتين.
- تحليل الأنسجة لتحضير عينات البروتين للتحليل.
النتائج الرئيسية
- الاستخلاص الناجح للبروتين من صمامات القلب الجنينية.
- تحضير عينات مناسبة لتحليل لطخة ويسترن (western blot).
- توضيح تقنيات التشريح من أجل تعلم فعال.
- تقييم مستويات تعبير البروتين في أنسجة القلب النامية.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول دراسة فعالة للتعبير البروتيني في صمامات القلب الجنينية.
- تعد الوسائل المساعدة البصرية ضرورية لإتقان تقنيات التشريح.
- يمكن لهذه الطريقة أن تدفع عجلة الأبحاث في مجال تطور القلب والمجالات ذات الصلة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح عزل البروتين من الأنسجة الجنينية المحدودة الكشف عن تنشيط مسارات التأشير في نماذج النمو المبكر. ويدعم هذا النهج التحقق من صحة الأهداف من خلال توفير بيانات شبه كمية عن البروتينات المفسفرة من مناطق الصمام التي تم تشريحها مجهرياً وتجميعها. تعالج هذه الطريقة عقبة رئيسية في الأبحاث قبل السريرية حيث تعيق ندرة العينات الحد من المخاطر الميكانيكية للأهداف القلبية الوعائية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في تطور الصمامات القلبية من خلال الكشف عن بروتينات الإشارات المفسفرة مثل pSmad1/5/8.
- القيمة التشغيلية: يوفر سير عمل قابلاً للتكرار لاستخلاص البروتين من أربع مناطق في الصمام الأبهري للفئران في المرحلة E13.5، حيث تنتج كل منطقة حوالي 1 µg من البروتين.
- القيمة التنبؤية: يدعم عملية فرز المحفظة البحثية من خلال السماح بالتقييم شبه الكمي لتنشيط المسارات في الأنظمة الجنينية ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير عينات بيولوجية موثقة لتحليل western blot اللاحق، مما يتيح تقييماً موثوقاً للمركبات في الفحص المظهري.
- القيمة التشغيلية: توحيد بروتوكولات التحلل والتجانس باستخدام محلول منظم قائم على Tris مع مثبطات البروتياز ومحلول SDS-sample buffer للمسخ البروتيني.
- القابلية للتوسع: تتيح إعادة استخدام المنصة عبر نقاط زمنية تطويرية مختلفة عن طريق تجميع الأنسجة للتغلب على قيود انخفاض عائد البروتين.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- الاستمرارية الترجمية: تربط بيانات التعبير البروتيني في مرحلة الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال نسب pSmad/β-actin متسقة عبر مختلف أحجام العينات.
- تقليل مخاطر الآليات: يقلل من الغموض في ارتباط الهدف عن طريق تأكيد استبعاد عضلة البطين عبر غياب علامات MYL2V و ANP في مناطق الصمام.
- الثقة التنبؤية: تتيح اتخاذ قرارات تطوير معدلة حسب المخاطر عن طريق ربط أنماط التعبير البروتيني بمراحل النمو باستخدام ضوابط داخلية.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الأهداف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، وذلك من خلال توفير قراءات ميكانيكية من أنظمة جنينية ذات صلة بالمرض.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال الكشف عن بروتينات الإشارات المفسفرة في أنسجة الصمام.
- الفحص: توفر عينات جاهزة للمقايسة مع استخلاص قياسي للبروتين، مما يسمح بنتائج قابلة للتكرار في تحليل لطخة وسترن لفحص المركبات.
- التحليلات: تولد قياسات كمية للمتغيرات التابعة عبر شدة الإشارة الكيميائية المضيئة المتناسبة مع حجم تجمع البروتين، مما يدعم التحليل المقارن للحالات.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف الجنيني إلى النماذج قبل السريرية من خلال الحفاظ على أنماط تعبير محددة للمسارات يمكن الكشف عنها في لطخات منفصلة لكل من Smad الكلي وβ-actin.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس قدرة قابلة للتوسع لعزل البروتين عبر الدراسات القلبية الوعائية الجنينية، مما يقلل من تكرار تطوير البروتوكولات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال تمكين الكشف عن البروتينات المفسفرة ذات الوفرة المنخفضة من الأنسجة التي تم تشريحها مجهرياً.
- القيمة التشغيلية: تعزيز إمكانية التكرار والتوحيد القياسي من خلال تحديد أحجام التحلل، والتجانس القائم على الخرز، والتحضير المتسق للعينات من أجل تحليل western blot.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف عن العمل من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في التقييم المبكر لأهداف القلب والأوعية الدموية.
- التأثير على المحفظة: تسهيل تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير بيانات شبه كمية لتنشيط المسارات من مناطق الصمام الجنيني.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التشريح الدقيق للبنى القلبية الجنينية لعزل مناطق الصمامات دون تلوث من عضلة البطين.
- يعتمد على أجهزة التجانس (جهاز تحلل باستخدام خرز من الفولاذ المقاوم للصدأ) والطرد المركزي عند 13,100 × g لتنقية العينة.
- يستلزم توحيد معايير أحجام محلول التحلل (الحجم النهائي 40 µL) واستخدام مثبط البروتياز بين الفرق لضمان اتساق العينات.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند تطبيق البروتوكول على أنسجة جنينية أخرى أو مراحل نمو تتجاوز مناطق الصمام الأورطي في المرحلة E13.5.
- يتضمن قيوداً عملية مثل عدم القدرة على تقدير إجمالي البروتين عبر القياس الطيفي بسبب انخفاض المردود، مما يتطلب الاعتماد على تحليل western blot شبه الكمي.
