باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل أنواع الخلايا العصبية الفردية من أنسجة المخ لتحليلها لاحقا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تفكيك الأنسجة العصبية أولا في معلق خلية واحدة. في الخطوة الثانية ، تتم إزالة المايلين من المعلق ثم يتم تلطيخ الخلايا للأجسام المضادة الخاصة بنوع الخلية.

في الخطوة الأخيرة ، يتم فرز مجموعات الخلايا الفردية عن طريق قياس التدفق الخلوي. في النهاية ، ستسمح طريقة العزل المحدد لنوع الخلية للمستخدمين بفحص التغييرات في التعبير الجيني أو البروتيني أو التعديلات اللاجينية بطريقة محددة لنوع الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل أنواع الخلايا التي تعبر عن مستقبلات معينة ، والتي تعبر عن بروتينات معينة ، والتي تعبر عن بعض التعديلات اللاجينية حتى نتمكن من فهم الآليات الخاصة بنوع الخلية في الدماغ بشكل أفضل.

ابدأ التفكك العصبي باستخدام شفرات حلاقة معقمة لتقطيع كل عينة يتم حصادها من أنسجة المخ البالغة إلى قطع صغيرة من 30 إلى 400 ملليغرام على غطاء صفيحة ثقافة بستة آبار. ثم اغمر الأنسجة في ملليلتر واحد من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم واستخدم ماصة لنقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة ملليلترين عند جمع جميع الأنسجة. الطرد المركزي للعينات وشفط المواد الطافية.

أضف 1،900 ميكرولتر من الإنزيم الدافئ. امزج واحدة واحتضن العينات لمدة 15 دقيقة. في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، قم بقلب الأنبوب عدة مرات كل خمس دقائق لإعادة تعليق قطع الأنسجة المستقرة.

في نهاية الحضانة ، أضف 30 ميكرولترا من الإنزيم الطازج. امزج اثنين لكل عينة واقلب الأنابيب برفق. ثم باستخدام ماصة الآفات المسماة واحدة، افصل كل عينة ب 30 تكرارا لأعلى ولأسفل.

الحرص على تجنب توليد الفقاعات. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية مع انعكاس كل خمس دقائق ، متبوعا بتفكيك العينات بماصة الآفات. رقم اثنين ، كما هو موضح للتو.

ثم قم بالتبديل إلى الماصة رقم ثلاثة ، وكرر التفكك واحتضان العينات لمدة 10 دقائق أخرى. في الحمام المائي مع الانعكاس كل خمس دقائق في نهاية الحضانة ، يتم تعليق الخلية المفردة من خلال مصافي خلية 80 ميكرون في أنابيب فالكون سعة 15 مل. غسل كل مصفاة ب 10 ملليلتر من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم لإيقاف التفاعلات الأنزيمية عند تصفية العينة الأخيرة ، قم بتدوير الأنابيب وشفط المواد الطافية لاستنفاد المايلين من الخلية.

المعلقات بإعادة تعليق الكريات تماما في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ، وتضيف الكمية المناسبة من حبات إزالة المايلين إلى كل أنبوب. قم بعرض المحاليل لأعلى ولأسفل حتى تختلط الخلايا والخرز جيدا. ثم احتضان العينة عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، اغسل كل عينة في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين أثناء دوران الخلايا ، ضع عمودا واحدا لكل عينة في المجال المغناطيسي لفارز مغناطيسي وضع مرشحا نظيفا 80 ميكرون فوق كل عمود. اشطف كل مرشح وعمود بملليلتر واحد من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ثلاث مرات لجمع كل التدفق في حاوية النفايات. بعد الشطف النهائي ، ضع خمسة مليلتر من البوليسترين أنابيب سفلية مستديرة أسفل كل عمود مباشرة لجمع الشطف.

ثم استنشق السوبر المسمى من العينات وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين. قم بتطبيق معلقات الخلية على الفور على الأعمدة ، وجمع الخلايا في الأنابيب أدناه. ثم اشطف كل مرشح وعمود أربع مرات باستخدام مليلتر واحد من إزالة المايلين ، عازلة لكل غسلة.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتدوير الخلايا وشفط المواد الطافية لتلطيخ الخلايا لفرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي. دوامة كل عينة لمدة ثانيتين تقريبا لفصل الكريات ونقل ميكرولتر واحد من الخلايا من كل أنبوب إلى أنابيب فردية. بالنسبة لعناصر التحكم في التلوين ، أضف على الفور خمسة ميكرولترات من كتلة FC إلى كل أنبوب ، بما في ذلك أدوات التحكم في التلوين.

ثم قم بدوامة العينات مرة أخرى واحتضانها عند أربع درجات مئوية. بعد خمس دقائق ، أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الأولية المناسبة. قم بتغطية الأنابيب لحماية الأجسام المضادة من الضوء واحتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، اغسل العينات في ملليلترين من محلول الغسيل ، ثم استنشق المواد الطافية وقم بتسمية كل عينة ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المناسب. غطي الأنابيب وضعيها على أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم اغسل العينات في ملليلترين من أجهزة الطرد المركزي للغسيل ، ثم استنشقها.

المواد الطافية Resus ، قم بتعليق الكريات في 250 ميكرولتر من PBS المعقم وفرز الخلايا هنا تظهر مجموعات ممثلة للتدفق من الخلايا العصبية من حصين ذكر واحد ، تم عرض الخلايا المسورة أولا من جميع الأحداث المحتملة بناء على خصائص التشتت الأمامية والجانبية. بعد ذلك ، تم بوابات الخلايا المفردة أو المفردات من أي مزدوجات أو كتل أكبر من الخلايا بناء على حجمها للسماح بالفرز الدقيق لأنواع الخلايا الفردية ، ثم تم فرز الخلايا المفردة إلى خلايا CD 11 و B إيجابية و CD 11 B سلبية مع مزيد من الفرز للخلايا السالبة CD 11 B إلى خلايا موجبة GT one و TH واحد. ثم تم استخدام برنامج التحليل لتحديد العدد الإجمالي للأحداث في كل مجموعة سكانية بالإضافة إلى النسبة المئوية للمجموعات الأصلية لتأكيد نقاء الخلايا التي تم فرزها.

في هذا المثال بالذات ، تم تحليل التعبير الجيني النسبي لجينات معينة من نوع الخلية البديلة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. كما هو متوقع ، أكدت هذه البيانات نقاء الخلايا التي تم فرزها ، بالإضافة إلى تحديد بعض الاختلافات المثيرة للاهتمام عبر مناطق الدماغ التي تم فحصها. بعد تأكيد نقاء النوع ، يمكن قياس التعبير عن الجينات الأخرى ذات الأهمية لتحديد نوع الخلية المحدد الذي يتم التعبير عنها فيه ، أو ما إذا كان تعبيرها قد تم تغييره بعد العلاج بطريقة محددة لنوع الخلية.

على سبيل المثال ، هنا تم التحقيق في التعبير عن ارتباط البقر ، وهو بروتين مرتبط بالكالسيوم يستخدم غالبا لتحديد الخلايا العصبية في الحصين والمخيخ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل أنواع معينة من الخلايا العصبية من الاهتمامات ، مثل الخلية العصبية الموضحة هنا باستخدام الأجسام المضادة المناسبة لسطح الخلية.