التقييم الوظيفي والمورفولوجية من الحجاب الحاجز تعصيب من قبل الحجابي موتور الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التقييم الكمي لكل من التعصيب الوظيفي والمورفولوجي للحجاب الحاجز بواسطة الخلايا العصبية الحركية الحجابية للحبل الشوكي العنقي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء تسجيل إمكانات عمل العضلات المركبة من الحجاب الحاجز في المخدرة بعد التحفيز الأقصى فوق العصب الحجابي المماثل. الخطوة التالية هي إجراء الكيمياء المناعية للحجاب الحاجز بالكامل لتقييم تعصيب الوصلات العصبية العضلية الفردية شكليا.

في النهاية ، يوفر الجمع بين إمكانات عمل العضلات المركبة وتحليلات الوصلات العصبية العضلية نهجا قويا للدراسة الكمية لتعصيب الحجاب الحاجز في نماذج القوارض من مرض الجهاز العصبي المركزي ومرض الجهاز العصبي المحيطي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصابة الحبل الشوكي ، مثل هل يمكن استخدام التدخلات العلاجية لاستعادة وظيفة الحجاب الحاجز بنجاح؟ تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أمراض مثل إصابة الحبل الشوكي الرضحية و ILS لأن وظيفة الجهاز التنفسي الحجابي تلعب دورا رئيسيا في نتائج المريض في كلتا الحالتين المنهكتين ، ويوضح الإجراء الدكتور كالي ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري ، ميلاني مارتن ، طالبة جامعية في مختبر الدكتور رايت ، وتمارا هولا ، فني أبحاث في مختبري.

بعد تخدير ، ضعه على اللوح الجراحي ، والجانب الظهري لأسفل وقم بتأمين الأطراف الأمامية على السبورة. ثم حلق السطح البطني من قاعدة الجمجمة باتجاه البطن على جانبي خط الوسط. بمجرد تنظيف الجلد ، ضع الأقطاب الكهربائية وربط الأرض بالذيل وضع القطب المرجعي في أسفل البطن المقابل تحت الجلد.

يجب تحضير قطب التسجيل بهلام موصل على الجزء ذاتي اللصق ثم توصيله على طول الهامش الساحلي أحادي الجانب. الآن ضع الأقطاب الكهربائية المحفزة ، عبر الجلد على بعد نصف سنتيمتر ، جانبية للقصبة الهوائية ومتفوقة على الترقوة. يجب أن تدخل بشكل عمودي على الجلد وتصل إلى عمق سنتيمتر واحد.

يجب أن تكون هذه الأقطاب الكهربائية مؤمنة جيدا ، ومن الأفضل القيام بها يدويا. قم بتوصيل جميع الأقطاب الكهربائية بالمحفزات ومكبرات الصوت المناسبة. يجب تسجيل البيانات التي تم جمعها على جهاز كمبيوتر.

للتحليل ، اضبط معلمات التحفيز لتحفيز القطب الواحد على 0.5 مللي ثانية ، نبضات واحدة هرتز قصوى. يمكن أن تتراوح السعة من ستة إلى ثمانية فولت. اضبط وقت تحفيز الاهتمام على 30 ثانية ، ومتوسط الاستجابة من 10 محفزات متتالية باستخدام خط الأساس لسجل ذروة السعة من كل مرة واحدة في الأسبوع تقريبا إذا رغبت في ذلك.

تفصيل التعامل مع في بروتوكول النص. بعد القتل الرحيم لحيوان باستخدام جرعة زائدة من التخدير عن طريق الحقن ، قم بإجراء شق البطن باستخدام مشرط أو مقص. قم بعمل شق من عملية الخنجري بشكل لطيف على طول خط الوسط.

ثم باستخدام مشرط وملقط ، افصل الجلد والأنسجة الضامة بعناية عن العضلات. قم بإزالة الحجاب الحاجز عن طريق سحب عملية الخنجري وقطع الحجاب الحاجز من العظم المحيط. احرص على عدم إتلاف عضلة الحجاب الحاجز.

انقل الجانب العلوي للحجاب الحاجز لأعلى إلى طبق خط سيليكون مملوء ب 4٪ ألدهيد بارافورم في PBS تحت مجسم مجسم. قم بتثبيت الأنسجة المحيطة بالحجاب الحاجز ، مع تمديد الحجاب الحاجز مشدودا. ثم قم بإزالة النسيج الضام من السطح العلوي باستخدام الملقط والمقص.

اترك المثبت يعمل لمدة 20 دقيقة ثم قم بإزالته باستخدام ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في PBS. بعد ذلك ، ضع 0.1 مولار جلايسين مع 2٪ BSA في PBS لمدة 30 دقيقة. ثم احتضان الحجاب الحاجز في قضيب دومين المترافق ألفا بنغل الحل لمدة 15 دقيقة.

اغسل سم البنغل باستخدام PBS كما هو الحال مع المثبت. بعد ذلك ، قم بتغيير الحمام إلى الميثانول البارد وقم بتبريد الأنسجة لمدة خمس دقائق عند سالب 20 درجة مئوية. بعد خمس دقائق على الفور ، قم بإزالة الميثانول وغسل المنديل باستخدام PBS كما كان من قبل.

الآن ، قم بتطبيق كتلة باستخدام حل 0.2٪ TBP لمدة ساعة واحدة. قم بتغيير المحلول إلى الجسم المضاد الأساسي في 0.2٪ TBP واترك الأنسجة تحتضن طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع تحريض لطيف. في اليوم التالي ، استخدم ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في 0.2٪ TBP لإزالة الجسم المضاد الأساسي ، ثم احتضان الأنسجة في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة مع التأرجح وفي الظلام لاحقا ، استخدم ثلاث غسلات في PBS لإزالة الجسم المضاد الثانوي والحفاظ على الأنسجة في الظلام.

ثم تحت المنظار المجسم ، قم بإزالة المزيد من النسيج الضام على السطح العلوي للعضلة. بمجرد تنظيفها ، قم بتحليل مورفولوجيا الحجاب الحاجز الملون الملون الملطخ وتصويرها تحت مجهر مضان epi المستقيم. استخدم تكبير 20 و 40 × لأنه يتم تحليل الحجاب الحاجز كحامل كامل.

معظم تلطيخ الفلورسنت خارج نطاق التركيز. باستخدام مجهر قياسي ، من الأفضل إجراء التحليل في الوقت الفعلي. من أجل تسجيل مورفولوجيا NM js الفردية بشكل صحيح ، قسم العضلات إلى ثلاثة أقسام للتحليل بناء على أنماط التعصيب الطبوغرافية للحبل الشوكي.

بدءا من منطقة معظم البطنية ، لا تحلل جميع njs المرئية على طول ألياف العضلات ولا تحلل أعمق من الألياف الثلاثة إلى الأربعة الأولى من السطح لأن اختراق الأجسام المضادة لا يكتمل أبدا. يحتوي NMJ السليم على محور عصبي قبل المحطة السميكة وتتداخل جميع مناطق الطرف العصبي تماما مع مستقبلات الأستيل كولين العضلية الأساسية. سوف يكون جزئيا دي NMJ غير العصبي بعض المناطق من مستقبلات الأستيل الأساسية غير مشغولة.

لن يظهر NMJ منزوع التعصيب تماما أي مراسلات مع مستقبلات الأسيتيل كولين في الطرف العصبي. يجب أن تظهر njs الأخرى في المنطقة مورفولوجيا أخرى أو نجاح الأجسام المضادة سيكون الاختراق موضع تساؤل إذا كان أكثر من محور عصبي قبل المحطة الطرفية يعصب NMJ. يتم ضرب NMJ.

قد يكون نزع التعصيب قد حدث في هذه الحالة ، يليه إعادة التعصيب. إذا كان هناك تداخل في الطرف العصبي مع مستقبلات الأسيتيل كولين الأساسية وكان المحور العصبي قبل المحطة الطرفية رقيقا جدا ، فإن NMJ يتم تعصيبه بشكل رقيق. هذا أيضا مؤشر على إعادة التأهيل.

في تجربة شملت spra للبالغين ، تلقت عناصر التحكم في فئران دوللي استئصال الصفيحة الفقرية بينما تلقى آخرون كدمة نصفية من جانب واحد. في C أربعة. بعد خمسة أسابيع ، تم تسجيل ذروة سعة cmap من الحجاب الحاجز الهيمي المماثل إلى استئصال الصفيحة الفقرية أو موقع الإصابة.

تم تخفيضه بشكل كبير في فئران اصابات النخاع الشوكي مقارنة باستئصال الصفيحة الفقرية فقط في الفئران في تجربة مختلفة تنطوي على الفئران التي تعبر عن الإنسان المتحور ، لذلك D بروتين واحد ليكون بمثابة نموذج ل LS. كان مورفولوجيا NMJ في الحجاب الحاجز الهيمي سليمة تماما في التحكم من النوع البري. ومع ذلك ، في الفئران المعدلة وراثيا ، أظهرت njs أمراضا كبيرة. أظهر البعض إزالة التعصيب الكاملة التي تميز بها رأس السهم.

تم إزالة التعصيب جزئيا من njs الأخرى كما هو موضح برأس السهم ، وكما هو موضح في NMJ على اليمين ، تم تعدد njs الأخرى بشكل متعصب ، وكان لدى البعض الآخر محاور رفيعة قبل المحطة هنا مميزة برأس سهم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقييم الكمي لكل من التعصيب الوظيفي والمورفولوجي للحجاب الحاجز بواسطة الخلايا العصبية الحركية الحجابية. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في جميع تجاربك.