في فيفو ديناميات الشبكية دبقية التنشيط خلال تنكس عصبي: متحد البؤر Ophthalmoscopic التصوير والقياس الشكلي خلية في الماوس الزرق

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة في نموذج فأر للجلوكوما المزمنة عن طريق التصوير متحد البؤر في الجسم الحي لشبكية العين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تنظير العين متحد البؤر الشهري غير الجراحي أو CSLO لعرض الخلايا الدبقية الصغيرة الفلورية على شبكية العين ورأس العصب البصري. تحليل الصور الحية باستخدام تجزئة SOMA للخلية القائمة على العتبة ومورفو يحدد التغيرات في عدد الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيطها.

تظهر النتائج أنه يمكن استخدام تصوير CSLO الشهري في الفئران الحية لمراقبة حركية توزيع كثافة الخلايا الدبقية الدقيقة والتنشيط المورفولوجي أثناء التقدم المبكر للتنكس العصبي المزمن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التصوير متحد البؤر الفوتوني لدماغ الفأر الدبقي الصغير الإيجابي GFP هي أن تصوير CSLO لشبكية العين يسمح بالمراقبة المباشرة ومراقبة الخلايا الدبقية الدقيقة طوال تطور الاضطرابات التنكسية العصبية للشيخوخة في الكائن الحي السليم. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد أن أظهرنا exvivo ، أن الخلايا الدبقية الصغيرة أظهرت تنشيطا مكثفا وتجمعا في الاستعداد المركزي ل DBA الصغير من خلال الفئران J في الأعمار التي سبقت التنكس العصبي القابل للاكتشاف.

من أجل السؤال عما إذا كانت هذه التغييرات المناعية الفطرية المبكرة التي سبقت الجلوكوما التي يمكن اكتشافها تسببت في تنكسها العصبي ، احتجنا إلى إنشاء نهج في الجسم الحي لتتبع التغيرات الدبقية الدقيقة. سيتم توضيح إجراء الحصول على الصور الحية قيصر روميرو ، فني مختبري لبدء العمليات ، وبدء تشغيل نظام CSLO وإدخال معلومات الجلسة. بعد ذلك ، استعد للتصوير بشكل آمن.

قم بتوصيل عدسة موضوعية نظيفة واسعة النطاق بزاوية 55 درجة. ضع فأرة فوق منصة التصوير بعد دقيقتين من إعطاء التخدير وقم بتوسيع كلا التلاميذ باستخدام قطرات الشعر. بعد خمس دقائق ، تأكد من تخدير الفأر.

بعد ذلك ، باستخدام الحد الأدنى من الضغط ، قم بتغطية كل عين بالعدسات اللاصقة. قم بتوجيه الماوس بحيث تلتقي العين اليمنى بالعدسة الموضوعية ويكون المدار موازيا للعدسة. لا يحتاج إلى تقييده ولكن يتم الحفاظ عليه على مسافة ثابتة من العدسة الموضوعية.

مع محاذاة العين معها لمدة 10 إلى 15 دقيقة القادمة ، لن يتحرك الماوس أو يومض أثناء تتبع حركات عينيه بواسطة نظام التصوير المباشر CSLO. ابدأ جلسة التصوير بجمع رؤية قاع العين للشبكية الداخلية. لهذا.

حدد وضع الأشعة تحت الحمراء ، والذي يتوافق مع الطول الموجي للإثارة البالغ 820 نانومتر. ثم اضبط طاقة الليزر على 100٪ والحساسية إلى ما بين 40 و 60٪ بعد ذلك ، العمل بسرعة عالية ، حدد موقع العين باستخدام عصا التحكم لتوجيه منظار العين والاستعداد لجمع عرض قاع العين للقرص البصري والأوعية الدموية في الشبكية. افحص القرنية والعدسة بحثا عن الإصابة أو التعتيم.

استبعاد من الدراسة عيون بها عيوب أو إصابات قد تؤثر على اكتساب الصورة. الآن من خلال تقريب الهدف من العين ، حدد موقع منطقة القرص البصري ، وهي سطح رأس العصب البصري أو ONH. ثم قم بتوسيط الصورة على ONH.

وضع ONH بشكل صحيح أمرا أساسيا للحصول على تركيز متساو ومهمة عبر الصورة. الخطوة التالية هي تصور المستويات الداخلية لشبكية العين وكذلك ONH. للحصول على مستوى بؤري مرجعي ، استخدم الأوعية الدموية الرئيسية الموجودة على السطح الزجاجي لشبكية العين ، والتي تتوافق مع 59 و 60 ديوبتر ، أو حتى أعمق عند 55 ديوبتر في مناطق القرص البصري المحفورة.

بعد ذلك ، اضبط تشبع الصورة باستخدام المقبض الموجود على لوحة اللمس حتى تمتد هالة بيضاء من الإضاءة إلى معظم قاع العين حول القرص البصري. ثم حدد التشبع السفلي الذي يجعل هالة موحدة تدل على التباين الأمثل لتلك العين. قد يكون من الضروري إعادة محاذاة الكاميرا إذا استمرت المناطق المظلمة.

الآن ، اجمع صورة قاع العين عالية الدقة للشبكية المركزية بمتوسط 30 إطارا تم التقاطها في الوقت الفعلي لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذا يتوافق مع 4.7 إطار في الثانية ، يتم تطبيعها على الفور وفي نفس الموضع المعدة لجمع صورة مضان للخلايا الموجبة GFP. قم بالتبديل إلى وضع التصوير الفلوري في لوحة الشاشة التي تعمل باللمس ، والتي تحدد الليزر الأزرق مع إثارة ليزر 488 نانومتر ومجموعة مرشح حاجز 460 إلى 490 نانومتر وضبط الاستحواذ على طاقة ليزر 100٪ وحساسية 100 إلى 125٪.

الآن اجمع صورة مضان ثنائية الأبعاد لنقطة XY واحدة ل ONH بمتوسط 100 × مسح ضوئي. بعد ذلك ، التقط صورة متعددة النقاط لشبكية العين حول مركب تحديد ONH في لوحة التحكم ، ثم قم بالتحريك باستخدام منظار العين عبر المحور الصدغي الأنفي. يقوم البرنامج تلقائيا بحساب متوسط المناطق الممسوحة ضوئيا حديثا وخياطتها في الوقت الفعلي.

إذا كانت جودة صورة مناطق شبكية العين غير كافية للسماح بحساب متوسط الدائرة الخضراء التي تحدد المنطقة التي يتم مسحها ضوئيا ستصبح حمراء. تغطي الصورة المركبة الناتجة مساحة تصل إلى 1.7 × أربعة ملليمترات. يجب توخي الحذر أثناء الحصول على الصورة المركبة.

يمكن أن تفقد الصور عالية الدقة عن طريق تحريك الهدف بسرعة كبيرة قبل الانتهاء من متوسط المسح الضوئي وخياطة الصور. عندما يبدأ التخدير في التلاشي ، يجب أن تنتهي جلسة التصوير لأن الفأر يبدأ في التنفس بقوة ويصبح التصوير غير عملي. ابدأ بمحاذاة صور قاع العين بالتتابع لسلسلة زمنية باستخدام الأوعية الدموية والقرص البصري كمعالم.

باستخدام برنامج تحرير الصور التقليدي ، قم بخط جميع الصور حتى يتداخل O hs الخاص بها. ستكون الصورة العلوية شبه شفافة أثناء السحب. ثم قم بتدوير كل صورة في التسلسل حتى تتداخل الأوعية الدموية الرئيسية مع الأوعية الدموية في الصورة السابقة واحفظ الترتيب للرجوع إليه في المستقبل.

سجل الزاوية المصححة لكل صورة وقم بتطبيقها على صورة مضان نقطة XY الفردية المقابلة. أصبح من الممكن الآن تحديد الخلايا الدبقية المجهرية الإيجابية GFP الفردية المترجمة في شبكية العين المركزية عن طريق فتح ملفات TIFF المحاذاة في عرض Fluor. لتصور كل الخلايا ، املأ الشاشة بالصورة وحدد عرض العرض المركب المتعامد والاقتحم.

ثم حدد الخصائص 0.58 جاما 255 نقطة التشبع 255 النصوع 195 ألفا عند التظليل 1.00. قم بإنهاء التحديدات عن طريق اختيار كلتا قناتي RG كمرئيتين. إخفاء القناة B بالنقر المزدوج فوقها في إطار مساحة العمل لتقسيم الخلايا الفردية.

حدد القناة الحمراء وعتبها عن طريق زيادة العتبة المنخفضة حتى يتم إخفاء غالبية الخلايا بالحد الأدنى من التداخل واستبعاد عمليات الخلايا مع الحفاظ على ثبات العتبة العالية. أخيرا ، احفظ الملف بخلايا مقنعة باستخدام أمر الالتقاط. افتح الصورة بخلايا مقنعة في محرر الرسومات النقطية هناك.

اقلب المقياس الرمادي للمراقبة المباشرة واضبط الدقة على 300 نقطة في البوصة أو أكثر. يتم حفظ صورة RGB كملف TIF. الخطوة التالية من تحليل الصور الحية هي من الخلايا الدبقية الصغيرة ، لذا فإن التجزئة والمورفو لتحديد SATA لقياس المنطقة الكمي.

استخدم برنامجا قادرا على قياسات الشدة وعد الكائنات بناء على العتبة. افتح ملف TIFF بخلايا مجزأة وحدد إعادة قياس الشريحة للحصول على أقصى دقة والقناة الحمراء بالأبيض والأسود للحصول على تصور أفضل. بعد ذلك ، قم بمعايرة الصورة عن طريق تحديد قطرها الأفقي على أنه 1.4 إلى 1.7 ملم اعتمادا على العمر لتقسيم الخلايا الفردية.

إذن MA ، قم بتطبيق عتبة الشدة على القناة الحمراء. افتح وظيفة الحد الكثافة ضمن الأمر count and account update. استخدم هذه الدالة لتتبع المعلمات ثنائية الأبعاد لكل حد من منطقة الاهتمام التي تمثل الفرد.

بعد ذلك ، حدد عتبة الشدة في الرسم البياني للشدة. حدد أدنى 50 إلى 60٪ من 255 مستوى وقم بتنقيح قيمة العتبة النهائية للخلايا الفردية. قم بتقييم التداخل بصريا بين قناع لون العتبة باللون الأزرق ومحيط سوما الخلية باللون الرمادي باستخدام عناصر التحكم في شريط الأدوات الثنائي أو كتالوج الكائنات.

تحديد المناطق الصومالية ذات الأهمية المتعددة يدويا. افصل بين هذه العناصر عن طريق الفصل بين مناطق الاهتمام. أثناء القيام بذلك ، استخدم مفتاح التبديل لتصور الخلايا مباشرة الآن باستخدام تقييد المنطقة.

تصنيف الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها نشطة. إذا كانت مناطق سوماتا أكبر من 50 إلى 60 ميكرون مربع. صنف الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها غير نشطة إذا كانت تحتوي على سوماتا أصغر.

أخيرا ، تحقق من العملية وتحقق من تعقيد التفرع في كل خلية دبقية صغيرة نشطة عن طريق تراكب القناع الصومالي وصورة نقطة XY المفردة مع زيادة التباين بنسبة 50٪ تم استخدام البروتوكول الموصوف لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة عبر مساحة كبيرة من شبكية العين المركزية. في DBA الصغير اثنين من الفئران J متغايرة الزيجوت التي تعبر عن CX ثلاثة C واحد GFP ، سمحت دقة الخلية العالية جنبا إلى جنب مع الصورة الحية والعتبة والتحليل المورفومتري بالتجزئة التلقائية للخلايا الإيجابية GFP الفردية ، وبالتالي يتم تمييز الخلايا بناء على منطقة DBA ، نموذج اثنين من الفئران J الجلوكوما المزمنة وتم تصويرها شهريا لمراقبة تطور الدبقية الدقيقة المحلية وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الأعمار التي تستمر في التنكس العصبي القابل للاكتشاف بما يتفق مع المتغير تطور التنكس العصبي في عيون الفرد. كشف هذا التحليل عن تغيرات في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الشبكية والانبساط الدقيق بمرور الوقت.

التحليل أيضا التغيرات الديناميكية في كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة الكلية والمنشطة داخل شبكية العين الفردية. لم تقترن الكثافة السكانية للخلايا الدبقية الصغيرة بالتغيرات في GFP التي تعبر عن كثافة الخلايا بما يتفق مع النتائج الأخرى. وبالتالي ، يمكن استخدام تحليل CSLO كمؤشر على تطور المرض المبكر.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين مستويات التشبع للصورة الفلورية ل GFP بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة بعناية ، وتوطين الشبكية الداخلية ، وقابلية تكرار صور CSLO للشبكية المركزية ، بالإضافة إلى التفاصيل الخلوية المتسقة التي تم اكتشافها عبر شبكية العين المركزية تعتمد بشكل حاسم على هذه الخطوة بعد تطورها. يتم تطبيق بروتوكول التصوير الحي هذا في مختبرنا ، ويهدئ حقا العلاقة المحتملة بين التغيرات المبكرة في الخلايا الدبقية الصغيرة لرأس الشبكية والعصب البصري ، والتقدم اللاحق للجلوكوما في DBA إلى JM وفي نماذج أخرى من تنكس الشبكية المزمن. قد تسمح استراتيجية التصوير الحي هذه أيضا بالكشف المبكر عن الأمراض المزمنة الأخرى التي تستهدف أيضا شبكية العين والعصب البصري للتنكس مثل التصلب المتعدد ومرض الزهايمر ومرض باركنسون.