طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور نشاط الإنزيمات في كل مكان في الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا إلى الطلاقة المشتركة العالية وحصادها لتسهيل إنتاج محللة مركزة كخطوة ثانية. يستخدم التحلل الميكانيكي اللطيف لإنتاج المحلل الذي يحافظ على صورة التمثيل الغذائي للسيتوبلازم للخلية.

بعد ذلك ، يتم تحضين الإنزيمات بمجسات مشتقة من الهيماجلوتينين من أجل تسمية إنزيمات دي يوبيكويتين من خلال التفاعل مع بقايا السيستين في الموقع النشط ، وتظهر النتائج ملامح نشاط العديد من إنزيمات دي يوبيكويتين بناء على النشاف الغربي والكشف الكيميائي اللاحق. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل النشاف الغربي العادي ، هي أنها تسمح للمستخدم بتصور أنشطة الإنزيمات المتعددة. في إحدى التجارب ، قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا بواسطة علي ، نقلا عن 30 مل من dobe docos ، أو وسيط النسور المعدلة ، أو DMEM بالإضافة إلى 10٪ مصل بقري جنيني في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للزراعة.

خلايا التجربة بنقل خلايا M 17 أو A المجمدة من تخزين النيتروجين السائل إلى دورق صغير بالماء الفاتر. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 30 مل من الوسائط. بعد ذلك ، أضف بعض الوسائط إلى قارورة الخلية وانقل الخلايا المعلقة في غضون خمس ثوان من الذوبان.

الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 450 Gs لمدة خمس دقائق للحصول على حبيبات الخلية. ثم أضف 20 مل من الوسائط في قارورة T 75. قم بإزالة الوسائط من الخلايا باستخدام الشفط.

أضف خمسة ملليلتر من الوسائط الطازجة إلى بيليه الخلية وتعليق النسخ. انقل خمسة ملليلتر من تعليق الخلية إلى 20 مل من الوسائط في قارورة T 75 وتحضنها 37 درجة مئوية. تغيير الوسائط كل ثلاثة أيام لحصاد الخلايا.

قم بإزالة الوسائط عن طريق الشفط ، مع الحرص على عدم لمس الخلايا. اغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. قم بإزالة PBS باستخدام الشفط.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من tripsin EDTA إلى قارورة T 75 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد الحضانة ، أضف ستة ملليلتر من الوسائط الطازجة إلى القارورة والريسوس. تعليق الخلايا.

انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 290 جيجا لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية وأضف خمسة ملليلتر من PBS. اضغط برفق على الجزء السفلي من الأنبوب لتفتيت الحبيبات قبل التمركز عند 290 Gs لمدة خمس دقائق. بعد تكرار غسل PBS ثلاث مرات ، قم بإزالة PBS القديم وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS الطازج.

ثم انقل الخلايا إلى أنبوب einor وتدور عند 290 GS لمدة خمس دقائق. لإجراء تحلل الخلية, قم بقياس الحجم التقريبي للحبيبات باستخدام ماصة ووزن الخرز الزجاجي ونسبة الكتلة إلى الحجم من واحد إلى واحد. أضف مخزن التحلل المؤقت إلى الحبيبات بضعف حجم الحبيبات.

ثم أضف الخرز الزجاجي إلى الحبيبات والتحلل. قم بتخزين الخلايا الموجودة في أنبوب einor بأقصى قدر من التحريك لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية عن طريق الدوامة في غرفة باردة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 200 GS لمدة 30 ثانية.

لتسوية الخرزات وجمع المادة الطافية. أضف نفس حجم الخرز الزجاجي كما كان من قبل إلى الدوامة الطافية ، مرة أخرى بأقصى تقليب لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية بعد التمركز لفترة وجيزة عند 200 جي ثانية لمدة 30 ثانية. لتسوية الخرز الزجاجي ، اجمع المادة الطافية.

أخيرا جهاز طرد مركزي عند 5 ، 030 GS لمدة خمس دقائق. لإزالة النوى والأغشية والخلايا غير المكسورة ، اجمع المادة الطافية ، وهي محللة الخلية لاشتقاق الأنسجة ، والتي يتم إجراؤها بواسطة حمض سينكو نيميك ، أو تحليل BCA. في لوحة 96 بئر لتحديد تركيز البروتين في المحللة باستخدام قارئ لوحة بئر 96 متري chole كما هو محدد في بروتوكول مجموعة فحص البروتين BCA.

بعد تحديد تركيز البروتين ، أحضر حصة مقابلة ل 20 ميكروغراما من إجمالي البروتين إلى 50 ميكرولترا باستخدام الماء منزوع الأيونات. ثم أضف ميكرولترين من 1.35 ميكرومولار من الهاتف الخليوي HAUB من الفينيل إلى المحلول. والنتيجة هي 20 ميكروغراما من المحللة إلى 50 نانو مولار من المسبار في خليط التفاعل النهائي.

هذا في الفائض المولي الكبير. لضمان وضع علامات على إنزيمات أو دبلجة de ubiquitin الوظيفية ، اترك المحلول يحتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت لعينة laly إلى المحلول.

بالنسبة لحجم تفاعل 52 ميكرولتر ، استخدم 26 ميكرولترا من عينتين × عينة مؤقتة ، أو 13 ميكرولترا من أربعة × عينة مؤقتة ، أو 8.87 ميكرولتر من ستة × عينة مؤقتة. احتضان العينة لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية. تبرد على الجليد.

قبل تحميل الجل لأداء اللطخة الغربية أولا تحميل 12 ، بئر أربعة إلى 20٪ تريس جليسين مع 40 ميكرولتر من العينة المحضرة. قم بتشغيل الجل على 95 فولت حتى تصل مقدمة الأيونات إلى القاع. ثم قم بإجراء نقل الجل طوال الليل إلى فلوريد DI أو غشاء PVDF بعد ذلك.

نقل أولا ، احتضان الغشاء في بقعة AMDO السوداء وامسح الغشاء للحصول على صورة توضح كمية البروتين في كل حارة. ثم احتجز الغشاء واحتضنه في 5٪ من الحليب في PBS لمدة ساعة واحدة لمنعه. بعد ذلك ، احتضان الغشاء في الجسم المضاد الأساسي المضاد ل HA بتركيز واحد إلى 10،000 في حليب 5٪ في PBS ، إما بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية أو لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق لكل منها في PBS مع 0.1٪ من المنظفات 20. ثم احتضان الغشاء في بيروكسيداز الفجل الحار بتركيز واحد إلى 10،000 في حليب 5٪ في PBS لمدة ساعتين على الأقل. قم بإجراء ثلاث غسلات كما كان من قبل ، تليها غسلة واحدة لمدة خمس دقائق في PBS.

أخيرا ، احتضان الغشاء في كاشف الكشف عن الإضاءة الكيميائية لمدة 10 دقائق واكتشافه باستخدام كاشف الاننار. استخدم إعداد التعريض الضوئي التلقائي على الكاشف. تم فحص تحميل البروتين باستخدام صبغة AM mito السوداء.

تضمن خطوة التحكم هذه أن الاختلافات في النشاط ترجع إلى العمليات الخلوية الفعلية وليس تحميل البروتين غير المتكافئ. تشير الممرات الموضحة هنا إلى استخدام كميات متساوية من البروتين في التجربة الأولى. في التجربة الثانية ، تم تحميل كميات البروتين غير المتكافئة بسبب الاختلافات المتوقعة في ملامح نشاط خطوط الخلايا المختلفة.

تم ذلك لضمان اكتشاف ملف تعريف النشاط لخلية M 17. التحلل المحتضن مع إيثيل مايد ، وهو مثبط للسيستين ويجب أن يؤدي إلى إشارة منخفضة على اللطخة الغربية. تم تحضين الأغشية في الجسم المضاد الأولي المضاد ل HA.

فأر حصان الفجل بيروكسيداز ، ثم تم اكتشافه باستخدام التصوير الكيميائي. يؤدي وضع العلامات الناجحة على الدبلجة باستخدام المجسات إلى ملف تعريف في كل حارة من الغشاء. تتوافق شدة العصابات عند الأوزان الجزيئية المختلفة مع مستوى نشاط إنزيم الدبلجة.

تصبح الاختلافات في مستويات نشاط الدبلات المختلفة عبر خطوط الخلايا واضحة عند مقارنة البروتينات المتشابهة مثل U و CHL one في خلايا he a و M 17. بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التجزئة تحت الخلوية من أجل الإجابة على أسئلة مثل ، كيف تؤثر العمليات المرضية على نشاط إنزيم اليوبيكويتين في العضيات المرتبطة بالغشاء؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس نشاط الإنزيم في كل مكان باستخدام مجسات موجهة للموقع النشط.