تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار كيفية عزل وزراعة العقد ثلاثية التوائم والجراثيم الأسنان. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعقيم الأجهزة الموائع الدقيقة وتركيبها وتغليفها أولا. الخطوة الثانية هي تشريح العقد ثلاثية التوائم وجراثيم الأسنان من مرحلة تنموية محددة في الفأر محل الاهتمام.

بعد ذلك ، يتم وضع العقد ثلاثية التوائم وجراثيم الأسنان في أجهزة الموائع الدقيقة وزراعتها بشكل مشترك. الخطوة الأخيرة هي إصلاح الخلايا وصخها باستخدام التألق المناعي. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري لإظهار نمط التعصيب الناتج عن الثقافة المشتركة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية ، مثل الثقافات المشتركة التقليدية ، هي أن هذه الطريقة تسمح بالزراعة المشتركة لأعضاء وأنسجة مختلفة لكل منها في ثقافتها المثلى. متوسط. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الابتكار الاصطناعي ، مثل دور الجزيئات المختلفة في ابتكار الأسنان وقاعدة الابتكار في نمو الأسنان. ابدأ بتعقيم أدوات التشريح ، والتي تشمل زوجا من ملقط التشريح الدقيق وزوجا من المقصات.

بعد ذلك ، قم بتعقيم دفعة من زلات الغطاء الزجاجي مقاس 24 ملم × 24 ملم عن طريق وضعها في محلول من حمض الهيدروكلوريك المولي على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم ، متبوعا بثلاث مرات شطف في 99٪ من الإيثانول ، وجففها تحت غطاء التدفق المعقم بمجرد أن يجف ، وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية للغطاء لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتخزين شرائح الغطاء في 70٪ من الإيثانول حتى تكون هناك حاجة إليها.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما لإزالة أجهزة الموائع الدقيقة لعزل المحاور العصبي بعناية من عبواتها ووضعها في طبق بتري معقم باستخدام ثقب خزعة معقمة بطول ملليمتر واحد. قم بإنشاء ثقب واحد في الأجهزة لكل عينة. في مراسلات غرف الثقافة.

احرص على عدم الضرب بالقرب من الأخاديد الدقيقة لأنها قد تتلف بسبب الضغط. بعد ذلك ، قم بتعقيم الأجهزة عن طريق إخراجها بنسبة 70٪ من الإيثانول. الحرص على إزالة كل الهواء المحبوس.

ثم قم بإزالة الأجهزة من الإيثانول وجففها تماما تحت غطاء تدفق معقم. أيضا ، قم بإزالة زلات الغطاء من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ واتركها تجف تحت غطاء التدفق المعقم. انتظر ثلاث ساعات على الأقل قبل المتابعة.

ضع كل زلة غطاء في بئر داخل ستة آبار. ثم ضع جهاز الموائع الدقيقة على زلة الغطاء واضغط برفق ولكن بقوة باستخدام الملقط للسماح بالالتصاق الكامل بين جهاز العزل والغطاء الزجاجي للانزلاق. بعد ذلك ، ماصة 150 ميكرولتر من 0.1 ملليغرام لكل مليلتر ، بولي دي ليسين في كل غرفة من غرف الاستزراع.

ثم ضع أجهزة الموائع الدقيقة تحت الفراغ لمدة خمس دقائق لإزالة كل الهواء من الغرف. إذا كان لا يزال من الممكن رؤية الهواء داخل الغرف. كرر محلول بولي دي ليسين في الغرف.

احتضان الأجهزة مع بولي دي ليسين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. اغسل الغرف ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم ، ثم املأ الغرف ب 150 ميكرولتر من خمسة ميكروغرام لكل مليلتر ، ومحلول عمل لامين ، واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإصلاح وسائط العقد ثلاثية التوائم ومزارع جرثومة الأسنان كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

نظف منطقة التشريح والمنظار المجسم بالإيثانول 70٪ وضع أدوات التشريح بعد التضحية. تشريح الجلد حول أسفل بطن الفأر الحامل مع المرحلة E 14.5 إلى E 17.5 أجنة الفئران. ثم افتح البطن بعناية باستخدام المقص.

حدد موقع الرحم وأخرجه وضعه في أنبوب مملوء بالثلج. يقوم Cold PBS بتشريح الأجنة ووضعها بشكل فردي في طبق بتري جديد مليء ب PBS المثلج. بمجرد إزالة جميع الأجنة من الأنسجة الجنينية الإضافية ، اقطع رأسها باستخدام المقص.

افصل الفك السفلي عن بقية الرأس باستخدام التشريح الدقيق والمقص ، مع الحرص على عدم إتلاف العقد ثلاثية التوائم. بعد ذلك ، خذ الرأس وضعه على طبق بتري زجاجي مبرد. استخدم الملقط لإزالة الجلد والجمجمة.

ثم ضع الملقط أسفل الرأس وارفعه. لإزالة الرأسي والمخيخ ، قم بتوطين العقد ثلاثية التوائم واستخدم الملقط وإبر التشريح لفصل العقد ثلاثية التوائم عن الأعصاب ثلاثية التوائم وتنظيف العقد. احتفظ بها في PBS البارد باستخدام إبر التشريح كسكاكين.

قم بإزالة اللسان والجلد المحيط بالفك. افصل بين الفكين الهيمي الأيسر والأيمن عن طريق القطع على طول خط الوسط للفك. ثم حدد موقع جراثيم الأسنان وعزلها باستخدام إبر التشريح بعد تشريح العقد ثلاثية التوائم وجراثيم الأسنان ، وقم بإزالة اللامينين من أجهزة الموائع الدقيقة واملأ الغرف ب 200 ميكرولتر من الوسائط المعنية.

باستخدام الملقط ، انقل العقد ثلاثية التوائم التشريح وجراثيم الأسنان برفق إلى الثقوب التي تم إنشاؤها باستخدام لكمة الخزعة. تأكد من أن جراثيم الأسنان لا تطفو وأنها تغرق حتى تلامس زلقات الغطاء. الثقافة ، العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قم بتغيير وسط الثقافة كل 48 ساعة لمدة 10 أيام لتغيير الوسيط. أولا ، قم بإزالة الوسيط عن طريق توجيه الماصة نحو الجانب الخارجي للآبار. ثم أضف وسط التدفئة الطازجة على جانب اللحام الموجود مقابل الغرف خلال فترة الاستزراع.

قم بتصوير الثقافات المشتركة في أي وقت باستخدام الفحص المجهري الضوئي. بعد فترة الاستزراع ، اغسل الغرف عن طريق سحب 150 ميكرولترا من PBS في بئر واحد لكل غرفة ، واترك PBS يتدفق عبر الغرف. كرر الغسيل ثلاث مرات بعد الغسيل الأخير.

قم بإزالة PBS وإصلاح العينات عن طريق سحب 150 ميكرولتر من الألدهيد Paraform 4٪ في PBS في بئر واحد لكل غرفة ، والسماح لها بالتدفق إلى الغرفة الأخرى. احتضان الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم اغسل الغرف مرتين باستخدام PBS واستمر في إجراء مزيد من التحليل مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي وتصوير النتوء.

أثناء زراعة الفحم ، تتفرع الخلايا العصبية من العقد ثلاثية التوائم من حجرة الثقافة وتمتد نحو جرثومة الأسنان النامية. عند تكبير أعلى ، يمكن للمرء أن يرى الخلايا العصبية تمتد عبر الغرف المحورية والأخاديد الدقيقة في جهاز الموائع الدقيقة. يمكن تتبع تقدم نمو الأعصاب بمرور الوقت لوصف تطور الابتكار.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الحمض النووي الريبي أو البروتين من أجل دراسة ، على سبيل المثال ، التغيرات في التعبير الجيني أو إفراز البروتين في الأنسجة المستهدفة بعد الابتكار.