الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير العمود الفقري المتغصني من الخلايا العصبية الحلقية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وتحديدها في ثلاثة أبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة زلات الغطاء أولا في ست ألواح آبار باستخدام البولي يوريثين واللامينين لزراعة الخلايا الجذعية العصبية. بعد ذلك ، يتم تخفيف الخلايا الجذعية العصبية في الثقافة.

يتم طلاء الوسط باستخدام حركة ماصة دوارة لطيفة ويسمح لها بالتمايز لمدة تصل إلى 70 يوما في المزرعة. عن طريق تجديد الوسط بانتظام ، يتم نقل الخلايا بفيروس العدسات GFP الملطخ بالأجسام المضادة ل GFP وتصورها. أخيرا ، يتم إصلاح الثقافات ويتم تصوير العمود الفقري المتغصني باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

في النهاية ، يتم إعادة بناء بيانات الصورة للأشواك التغصنية البشرية في 3D لتصنيفها وقياسها الكمي. يوفر هذا البروتوكول إجراء تدريجيا للحصول على الخلايا العصبية الجلوتاماتية من الطبقة الثانية إلى الرابعة من قشرة الدماغ البشري. يتضمن استخدام الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية القوية التي يسببها الإنسان والتي تنشأ من الخلايا الليفية البشرية بناء على الطريقة المنشورة سابقا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية لأساليبنا الحالية هي أنها تسمح بالتجزئة التلقائية لحق DON و PY في 3D. هذا مع مكاسب ملحوظة من الوقت على البرامج الحالية ، والتي عادة ما تستعد من التحليل ثنائي الأبعاد فقط. ال donr and spy في التصنيفات مفيد جدا وسهل الاستخدام أيضا.

لتحضير الثقافات العصبية ، ضع زلات الغطاء الزجاجي في ستة أطباق ثقافة جيدة وأضف بولي أورنيثين يحتضن طوال الليل تحت غطاء التدفق في اليوم التالي. استخدم DPBS لغسل زلات الغطاء ثلاث مرات وإضافة حاضنة اللامينين تحت غطاء التدفق لمدة 10 ساعات على الأقل. تحضير وسط الاستزراع الذي يحتوي على المكونات التالية.

ثم استخدم الوسيط للوحة وإرسال الخلايا الجذعية العصبية أو NSCS بكثافة 50،000 خلية لكل سنتيمتر مربع ماصة مع حركات دوارة بطيئة من أجل تقليل تجميع الخلايا لنقل الخلايا العصبية البشرية المشتقة من IPSC. في أي خطوة من خطوات النضج ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون يحتوي على 40 نانوغراما من ناقل الفيروسات الكريهية الوركن العالمي لكل مزرعة تحتوي على وسط استزراع طازج ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. لتحضير الخلايا للتألق المناعي ، قم بإزالة وسط الثقافة واستخدم 4٪ فورمالديهايد لإصلاح الخلايا المنقولة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

ثم استخدم XPBS لغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد ذلك ، اغمر زلات الغطاء في PBS مكملا بمصل حصان 0.05٪ Triton X 110٪ واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم استخدم PBS لغسل زلات الغطاء ثلاث مرات.

أضف جسما مضادا أساسيا 1000 GFP في 100 ميكرولتر من مصل الحصان PBS 4٪ إلى كل زلة غطاء. احتضن في صندوق مظلم عند أربع درجات مئوية طوال الليل. الآن قم بتخفيف الجسم المضاد المترافق Alexa Fluor 4 88 من واحد إلى 200 في PBS 0.5٪ tween 20 ، واحتضان الخلايا بمحلول الجسم المضاد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد استخدام PBS لغسل الشرائح ثلاث مرات.

استخدم وسيط التثبيت لتركيب الشرائح للفحص المجهري الفلوري. تحت المجهر متحد البؤر ، حدد ما لا يقل عن 10 خلايا عصبية صحية لكل حالة مع مورفولوجيا شبه معدنية وشجرة شجيرية قابلة للطي لتحديد 60 إلى 100 ميكرومتر لكل تغصص. احصل على صور ذات هدف 40 × na و 1.3 زيتي وليزر 488 نانومتر مع طاقة ذروة نموذجية على مستوى العينة حوالي 20 ميكرو واط ، اضبط حجم البكسل حوالي 80 نانومتر لأخذ عينات من العمود الفقري الشجيري بشكل صحيح.

لأخذ عينات من حجم الخلايا العصبية بالكامل ، احصل على مكدس Z بتباعد Z من 150 إلى 300 نانومتر ، مما ينتج عنه 20 إلى 30 شريحة Z لإجراء القياس الكمي ثلاثي الأبعاد للأشواك المتغصنة. استخدم الإعدادات التالية لبرنامج التحليل للمعالجة المسبقة. استخدم التصفية الغوسية عن طريق اختيار معالجة الصور وتنعيم المرشح الغوسي.

اضبط عرض المرشح مساويا لحجم البكسل في المستوى XY لإجراء تتبع شبه تلقائي للتشعبات من وحدة تتبع الفتيل. في علامة تبويب الشريحة ، استخدم أداة المسافة لتقدير قطر التغصنات. بعد ذلك في علامة التبويب التي تم تجاوزها ، انقر فوق أداة الخيوط واختر تخطي الإنشاء التلقائي لتحسين المتانة في علامة التبويب الرسم.

تم تقديمه الآن تحديد المسار التلقائي كطريقة ، والتغصنات كنوع ، وإدخال قطر التغصنات المقدر. باستخدام وضع تحديد المؤشر ، قم بتحويل المؤشر إلى مربع واختر shift وانقر بزر الماوس الأيمن على نقطة بداية التغصن. سيقوم البرنامج بإجراء العمليات الحسابية الأولية.

الآن حرك المؤشر على طول التغصنات من نقطة البداية. يظهر خط أصفر يمثل مسار التغصنات الأكثر احتمالا. اضغط على shift ولليسار.

انقر فوق نقطة نهاية التغصنات لإجراء تجزئة تلقائية للعمود الفقري في واجهة الوحدة النمطية. انقر فوق علامة تبويب الإنشاء في قائمة إسقاط إعادة البناء. اختر إعادة بناء قطر التغصنات وحدد مربع الاحتفاظ بالبيانات.

ثم انقر فوق إعادة البناء. قم بتعيين الحد بحيث يتوافق الحجم المجزأ مع حجم التغصنات الفعلي. كخوارزمية، حدد أقصر مسافة من خريطة المسافة.

ثم انقر فوق الزر التالي أسفل علامة تبويب الشريحة ، وحدد أصغر عمود فقري وقطر الرأس والحد الأقصى للطول. ثم ضمن علامة التبويب تجاوز ، أدخل قيم المعلمات حوالي 200 إلى 300 نانومتر للقطر الأدنى وأربعة ميكرومتر للطول الأقصى هي نقاط انطلاق جيدة دون تحديد مربع السماح بالعمود الفقري ، انقر فوق الزر التالي. بعد ذلك ، اضبط عتبة نقاط البذور بحيث تكون النقاط الزرقاء التي تمثل العمود الفقري مترجمة إلى رؤوس العمود الفقري الفعلية.

ثم انقر فوق التالي. سيتم الآن إجراء الحساب الأساسي ويمكن أن يستغرق بعض الوقت لتصنيف العمود الفقري ضمن علامة تبويب الأدوات في واجهة الوحدة النمطية ، انقر فوق تصنيف العمود الفقري. بعد التحقق من وجود أربع فئات كما هو موضح في بروتوكول النص ، ستقوم واجهة الوحدة النمطية بإنشاء أربعة كائنات خيوط جديدة مع نتائج التصنيف.

أخيرا ، قم بتصدير البيانات الإحصائية ضمن علامة التبويب الإحصائيات بالنقر فوق تصدير جميع الإحصائيات إلى ملف. يوضح هذا الشكل ثقافة الخلايا العصبية البشرية المسماة بالجسم المضاد المضاد لبيتا ثلاثة توبولين. يتضح هنا أيضا الاتجاه إلى تجميع الخلايا.

يظهر هنا خلية عصبية شبه معدنية تحمل علامة GFP بعد 40 يوما من التمايز من السلف القشري المتأخر. من الطبقات القشرية السطحية. يظهر الجزء الداخلي تكبيرا أقل مع جسم الخلية الظاهر.

تمثل هذه اللوحات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لأجزاء من العمود الفقري الشجيري في مراحل مختلفة من النضج. يظهر هنا التحليل الكمي لكثافة العمود الفقري وحجم رأس العمود الفقري. كما هو متوقع ، تزداد هاتان المعلمتان خلال فترة الثقافة.

أثناء البند محاولة إجراء الثقافة, من المهم أن لوحة وإرسال بعناية فائقة الخلايا الجذعية العصبية عن طريق إضافة الخلايا ببطء مع حركة الدورية لطيفة من أجل الحد من الكولين الخلية. في الواقع ، تتطلب هذه الطريقة تحديد الخلايا العصبية الفردية.