، أشار الطولي Eyeblink تكييف الكلاسيكية في الفئران ثابت رئيس

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام التطورات الجينية في الفئران، وفهمنا لنظام الشوارب، لاستقصاء الأساس النيوروبيولوجي لشرط رمش العين، وهو نموذج قابل للنقل لدراسة التعلم والذاكرة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على تساؤلات ميكانيكية في التعلم والذاكرة من خلال استخدام تصوير الكالسيوم والفيزيولوجيا الكهربائية في فئران معدلة جينياً أثناء تحفيز شوارب محددة خلال عملية الشرط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تثبيت رؤوس الفئران مع تقليل التوتر إلى أدنى حد، وذلك من خلال السماح للفئران بالتحرك بسرعتها الخاصة على جهاز مشي أسطواني.

تمتد آثار هذه التقنية نحو العلاجات المحتملة لاختلالات الذاكرة، بما في ذلك تلك المرتبطة بالشيخوخة الطبيعية ومرض الزهايمر. وقد تم تناول تحضير الأسطوانة ونظام تحفيز الشوارب كلٌ على حدة في البروتوكول النصي. ويغطي هذا القسم تحضير القطعة الرأسية.

شريط القطعة الرأسية عبارة عن شريط مطبوع ثلاثي الأبعاد يحتوي على سبعة ثقوب، وهو مصمم على غرار شريط النايلون من سلسلة Amphenol 221 التي لم تعد تُصنع تجارياً. من القطعة المطبوعة ثلاثية الأبعاد، قم بسن الثقب الأول في الشريط لبرغي آلي مقاس 0-80 وطوله بوصة واحدة، واترك ثقباً واحداً فارغاً بعد الثقب الأول. بعد ذلك، وباستخدام منجلة، ضع خمس دبابيس مطلية بالذهب في الثقوب الخمسة المتبقية.

ادفع الدبابيس عبر الثقوب الأضيق في البلاستيك. بعد ذلك، وباستخدام مقشر حراري، قم بإزالة نصف سنتيمتر من طلاء البوليميد. ثم، قم بلحام الطرف المقشر بأحد الدبابيس حيث يوجد فتحة في الدبوس.

اقطع السلك الملحوم ليكون طوله بين ستة وسبعة مليمترات، ثم قم بإزالة العازل عن حوالي مليمترين من السلك. الآن، كرر هذه العملية لتوصيل أربعة أسلاك إجمالاً بالدبابيس الخمسة. سيسجل السلكان الأولان استجابات EMG للجفن، بينما سيقوم السلكان الثانيان بتوصيل التحفيز الكهربائي إلى المنطقة المحيطة بالحجاج.

قم بلحام سلك من الفولاذ المقاوم للصدأ غير معزول بطول خمسة سنتيمتر في الدبوس الخامس ليكون بمثابة أرضي كهربائي. بعد إجراء جميع التوصيلات، افحص كل واحدة منها باستخدام المقياس المتعدد (multimeter) للتأكد من استمرارية التوصيل الكهربائي. ابدأ باستخدام حيوان مخدر بالكامل، يتم التأكد من ذلك عن طريق قرص إصبع القدم.

احقن جرعة من buprenorphine hydrochloride كمسكن للألم. ثم ضع كمية صغيرة من مرهم العيون على القرنيات واحلق الجزء العلوي من رأس الحيوان. بعد ذلك، ثبت رأس الحيوان في إطار التوجيه المجسم (stereotaxic frame) وعقم فروة الرأس بثلاث عمليات فرك متبادلة من povidone iodine والكحول.

باستخدام شفرة مشرط رقم 10 أو 15، قم بعمل شق على طول الخط المتوسط لفروة الرأس، بحيث يتم كشف الجمجمة من أمام العينين وصولاً إلى ما بعد العظم بين الجداري. قم بإرجاع سدائل الجلد باستخدام ست مشابك دقيقة، لكشف أكبر قدر ممكن من الجمجمة، بما في ذلك الجانبين والخلف. بعد ذلك، استخدم المشرط لكشط السمحاق عن الجمجمة.

بعد ذلك، قم بتنظيف الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 3% ثلاث مرات. وبمجرد جفاف الجمجمة، قم بحفر ثقبين باستخدام مثقاب مخروطي مقلوب من المقاس 34، مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ. ضع ثقباً واحداً أمام منطقة bregma، والثقب الآخر أمام منطقة lambda، إلى يسار الخط الناصف عند تهيئة العين اليمنى، أو العكس.

يجب حفر هذه الثقوب بعناية لتناسب البراغي، وينبغي بذل جهد كبير لتجنب إتلاف الدماغ. ضع البراغي في الثقوب لإجراء التوصيلات الكهربائية. كل دورة كاملة ستخفض البرغي بمقدار 0.28 millimeters، لذا فإن دورتين كاملتين تعدان كافيتين.

بعد ذلك، قم بعمل عدة ثقوب صغيرة في الجمجمة من أجل زيادة مساحة السطح المتاحة للإسمنت. ومن القطعة الرأسية المكتملة، قم بلف سلك التأريض على شكل رقم ثمانية حول المسمارين. اترك بعض الارتخاء في سلك التأريض لضمان إمكانية وضع القطعة الرأسية بشكل صحيح.

الآن، قم بوضع أسمنت الربط البارد. غطِّ الجمجمة والبراغي بكمية وفيرة واترك الأسمنت ليجف. بمجرد جفاف الأسمنت، ضع قطعة الرأس في وضع رأسي، بحيث تكون الدبابيس قائمة فوق الجمجمة.

ثبّت قطعة الرأس باستخدام حامل متصل بذراع من الإطار. يجب أن يحتوي الحامل على خمس مقابس مطلية بالذهب لاستقبال دبابيس قطعة الرأس. ضع سلكي تخطيط كهربية العضلات (EMG) على العضلة الدائرية العينية فوق محجر العين.

بعد ذلك، قم بتحديد موضع سلكي التحفيز. ضع النهايات المجردة تحت الجلد على مسافة تتراوح بين اثنين إلى أربعة مليمترات في الجهة الذيلية مباشرة من العين. تأكد من عدم تلامس نهايات الأسلاك مع بعضها البعض.

إذا كانت الأسلاك طويلة لدرجة قد تؤدي إلى خدش عين الحيوان، فقم بتقليمها أو ثنيها للخلف، مع التأكد من بقاء جزء من السلك العاري مكشوفاً. الآن، قم بتثبيت قاعدة الأسلاك في الجمجمة باستخدام كمية إضافية قليلة من أسمنت اللحام (luting cement) واتركها حتى تجف.

استخدم نصف الحجم المستخدم سابقاً تقريباً. للمتابعة، قم بإزالة المشابك الدقيقة (microclips) وأعد وضع الجلد في مكانه. اترك الجلد يستقر بشكل طبيعي لمنع حدوث شد عليه، مما قد يؤدي إلى تشويه الجفن وإعاقة الرمش، وبالتالي إفساد التجربة.

بمجرد استقرار الجلد، قم بإزالة حامل القطعة الرأسية وأغلق المنطقة المكشوفة باستخدام الأسمنت السني. تجنب تسييل الأسمنت على العينين أو على دبابيس القطعة الرأسية. ثم استخدم مسحة قطنية مبللة بمذيب الأسمنت السني لتنعيم وتشكيل الأسمنت المتصلب جزئياً حسب الحاجة.

بمجرد جفاف الإسمنت تماماً، أخرج الحيوان من الإطار التجسيمي (stereotaxic frame) واتركه ليتعافى على سطح دافئ قبل إعادته إلى قفصه الخاص. ابدأ في تعويد الفئران بعد منحها فترة تعافٍ لا تقل عن خمسة أيام. ولتثبيت الفأر، أمسكه لفترة وجيزة من الذيل لتقييده من خلف الكتفين.

بعد ذلك، ارفع الفأر من منطقة البطن والجذع. ثم، قم بتوصيل الموصل بالقطعة الرأسية وأدر برغي القفل. بعد ذلك، ضع الفأر برفق على الأسطوانة وثبته في مكانه مع استخدام برغيين لتثبيت الموصل بالقضبان الموجودة فوق الأسطوانة.

بعد ذلك، أطلق سراح الفأر. في الجلستين الأوليين، اترك الفأر يعتاد على الأسطوانة لنفس المدة الزمنية المخصصة لجلسة التكييف. وأثناء عملية الاعتياد، سجل معدل الرمش التلقائي.

علاوة على ذلك، قم بتعريض الفئران مسبقاً لمحفز اهتزاز الشوارب دون تطبيق تحفيز كهربائي. مع وضع نظام piezo بالقرب من الجانب المشروط، قم بتمرير أسنان المشط فوق الشوارب الفردية. اختر نفس الشوارب لكل جلسة.

بعد ذلك، يتم المضي قدماً في تدريب الإشراط الكلاسيكي كما هو موضح في النص. خضعت فئران ذكور من سلالة C57 Black 6J، تتراوح أعمارها بين ثمانية إلى عشرة أسابيع، للتدريب على إشراط رمشة العين من نوع الأثر (trace eyeblink conditioning) باستخدام جهاز المشي الأسطواني مع تثبيت الرأس. كما تم تسجيل تخطيط العضلات الكهربائي (EMG) لكل تجربة.

تم تقويم إشارات تخطيط كهربية العضلات (EMGs) ودمجها بثابت زمني قدره 10 millisecond، ثم حُسب متوسطها عبر جميع التجارب. يظهر تطور الاستجابات الشرطية على مدار 10 جلسات تدريبية أن سعة الاستجابة زادت تدريجياً بينما أصبحت فترة كامنة للاستجابة أقصر. لا يظهر هذا التطور في الاستجابات لدى الفئران ذات التكييف الوهمي، حيث قُدمت المحفزات بترتيب عشوائي.

يمكن أيضاً ملاحظة تطور الاستجابات الشرطية الموقوتة بدقة، وبالتالي المتعلمة جيداً، في الرسوم البيانية التكرارية للزمن اللازم للوصول إلى ذروة الاستجابة بعد بدء المثير الشرطي (CS). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجهيز القطعة الرأسية، وزراعتها جراحياً في رأس الفأر، ووضع الفأر على جهاز المشي الأسطواني، وذلك لإجراء عملية تكييف رمش العين مع تثبيت الرأس. يجب أن تظهر الفئران لديك منحنى تعلم جيداً على مدار الأيام أثناء اكتساب التكييف.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة واحدة إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر البقاء يقظاً في مراقبة أي علامات ضيق تظهر على الحيوانات، مع ضرورة اتخاذ الخطوات المناسبة لتقليل التوتر الذي تتعرض له الحيوانات.