تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية

الهدف العام من تقنية التصوير والتحليل هذه هو عزل معلومات محددة عن إشارة معقدة. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية تصور وقياس الميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب مع الميتوكوندريا الأخرى داخل البشرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل كيف تقارن الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية داخل البشرة للأفراد الأصحاء بالميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب للمرضى الذين يعانون من مضاعفات عصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نأخذ إشارة معقدة ونستخرج معلومات محددة منها. يساعدنا هذا البروتوكول على عزل إشارة معينة مثل الإشارة الموجودة في هذه القشات عن الإشارات المحيطة بها. استعد لتلوين الكيمياء المناعية الفلورية لخزعات الجلد عن طريق وضع العلامات أولا على لوحة مكونة من 96 بئرا وفقا لهذا المخطط.

ثم قم بعمل ماصة 150 ميكرولترا من محلول محسن إشارة المخزون لتقليل الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية في كل بئر من الصف العلوي. قم بإعداد شطف الآبار عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن 1x من الفوسفات في كل بئر في الصفين الثاني والثالث من اللوحة المكونة من 96 بئرا. ثم أضف 150 ميكرولتر من محلول حجب BSA بنسبة 5٪ في آبار الصف الرابع.

قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية PGP9.5 و PDH في 1 ، 500 ميكرولتر من محلول شطف BSA 1٪ وأضف 150 ميكرولتر إلى كل بئر في الصف الخامس. استخدم حلقة تلقيح لنقل الأقسام إلى محلول محسن الإشارة في الصف الأول. بمجرد أن تصبح الأقسام في محلول الجسم المضاد الأساسي في الصف الخامس ، لف اللوحة بإحكام بغشاء مختبري لمنع التبخر ثم حرك العينات على هزاز مسطح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

احتضن مع التأرجح بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ابدأ اليوم الثاني من الإجراء عن طريق سحب 150 ميكرولتر من محلول شطف BSA بنسبة 1٪ على الآبار في الصفوف السادسة والسابعة والثامنة من اللوحة المكونة من 96 بئرا. أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور إلى 1،500 ميكرولتر من 1٪ BSA.

ثم ماصة 150 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الثانوي في كل بئر من الصف التاسع. اشطف الأقسام بالمرور عبر الآبار السادسة والسابعة والثامنية. بمجرد أن تصبح الأقسام في محلول الجسم المضاد الثانوي في الصف التاسع ، لف اللوحة في بارافيلم وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم لحماية إشارات الفلورة.

احتضان مع التأرجح كما كان من قبل. في اليوم الثالث ، تمت ترشيح الماصة 150 ميكرولترا من المعقمة 1x PBS في الصفوف 10 و 11 و 12. انقل العينات إلى الصف 10 ثم قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم.

اشطفها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة بالهزاز. بعد ذلك ، قم بإعداد شريحة مجهر لتركيب الأقسام عن طريق سحب 50 ميكرولترا من 1x PBS المصفى على الشريحة. بمجرد اكتمال عمليات الشطف ، انقل قسما من الصف 12 إلى الشريحة ثم أضف قطرة إلى قطرتين من كاشف التثبيت الذي يحتوي على DAPI مباشرة أعلى القسم.

ضع برفق غطاء زجاجي مقاس 50 ملم × 24 ملم 1.5 مجهر فوق القسم. ضع الشرائح في الظلام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لمعالجة وسط التركيب قبل تخزين الشرائح أو تصويرها. حدد هدف الغمر بالزيت 40X على مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المقلوب.

حدد الليزر وأجهزة الكشف المناسبة لتصوير النوى والألياف العصبية والميتوكوندريا. أدخل معلمات المسح التالية في برنامج المجهر ، ودقة شدة 12 بت ، ومعدل مسح 500 هرتز بمتوسط إطارين ، وتكبير 2.2. اضبط برنامج المجهر للحصول على دقة جانبية محسنة عن طريق تحديد دقة مسح ضوئي تبلغ 1024 × 1024.

قم بتحسين الدقة المحورية والتقسيم البصري عن طريق تحديد فتحة متحدة البؤر لوحدة هواء واحدة بحجم خطوة Z يبلغ 210 نانومتر. امسح كل إشارة على حدة واضبط جهد الكاشف والإزاحة لإزالة أي وحدات بكسل مشبعة أكثر أو أقل. قم بتنشيط المسح المباشر للإشارة العصبية واضبط التحكم في التركيز بتركيز Z للعثور على المستويين البؤريين العلوي والسفلي وضبطهما في برنامج المجهر الذي يشمل الإشارة العصبية داخل قسم الأنسجة.

امسح سلسلة Z النهائية ضوئيا باستخدام مسح متسلسل للتخلص من الحديث المتبادل لإشارة التألق. اعزل البشرة عن الطبقة القرنية والأدمة عن طريق رسم منطقة حول البشرة باستخدام أداة تحديد على صورة مكررة للصورة الأصلية. ثم قم بقص الصورة إلى التحديد.

احسب وظائف انتشار النقطة للإشارات البؤرية الفلورية الخضراء والحمراء باستخدام ميزة حساب الدالة المنتشرة. ثم اضبط معلمات معامل الانكسار المتوسط للزيت عند 1.515 والفتحة العددية لهدف الزيت 40X عند 1.25. اضبط ثقب الكاشف في وحدة هواء واحدة واختر الطول الموجي للإثارة بالليزر.

استخدم مجموعة الاستعادة التكرارية على ثقة 100٪ ، وحد التكرار البالغ 10 دورات ، و PSFs الخضراء والحمراء لإزالة الاهتزاج من إشارات التألق الخضراء والحمراء. استخدم أداة إنشاء السطح لإنشاء سطح حول الإشارات العصبية غير الملتوية لتحديد ميزة إلغاء التحديد السلسة ، والكثافة المطلقة للعتبة ، وعتبة أقل من 3 ، 000 وعتبة عليا تبلغ 65 ، 535. حافظ على الأسطح فوق 10 فوكسيل.

قم بإزالة الأسطح غير العصبية باستخدام علامة تبويب التحرير في سطح العصب لتحديد أسطح مفردة غير عصبية أو اضغط باستمرار على مفتاح التحكم لتحديد أسطح غير عصبية متعددة. احذف الأسطح غير العصبية المحددة بالضغط على الزر حذف. استخدم علامة تبويب التحرير في سطح العصب واضغط على زر القناع الكل في خصائص القناع.

في النافذة الجديدة ، حدد القناة الخامسة من الميتوكوندريا التي تم فكها تحت تحديد القناة ثم تحقق من القناة المكررة قبل تطبيق القناع. اضغط على زر الاختيار للثبات من الداخل / الخارج وتحقق من ضبط فوكسل السطح الخارجي إلى 0.0 واضغط على الزر موافق. أخيرا ، قم بإنشاء أسطح خاصة بالميتوكوندريا باستخدام أداة إنشاء سطح لإنشاء سطح حول إشارات الميتوكوندريا المقنعة عن طريق تحديد ميزة إلغاء تحديد السلس واستخدام طرح الخلفية للعتبة.

اضبط قطر أكبر كرة على 1.50 ميكرومتر ، والعتبة الدنيا إلى 2 ، 000 ، والعتبة العليا إلى 65 ، 535 كحد أقصى. تأكد من إبقاء الأسطح أعلى من 1.0 فوكسل. توضح هذه الصورة المجهرية متحد البؤر ثلاثية الأبعاد إشارة التألق الأخضر الخاصة بالعصب.

يتم إنشاء سطح ثلاثي الأبعاد موضح باللون السماوي للإشارة العصبية. ثم يتم عزل إشارة الميتوكوندريا الخاصة بالعصب عن بقية إشارات الميتوكوندريا للبشرة باستخدام سطح العصب كأداة إخفاء. يتم استخدام إشارة التألق الأحمر للميتوكوندريا الناتجة الخاصة بالعصب لإنشاء أسطح تظهر على شكل أرجواني حول الميتوكوندريا داخل سطح العصب والتي تظهر في السماو.

هذا يسمح برؤية الميتوكوندريا في الألياف العصبية بالتفصيل. هنا ، يتم تقديم بيانات سطح الميتوكوندريا كرسم بياني لتردد الحجم لتصور النسبة المئوية للميتوكوندريا الموجودة في كل من الانحناءات المختلفة وفقا لحجمها. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم العناية بالأنسجة أثناء عملية التلوين للتأكد من أن الأنسجة مغمورة بالكامل في المحاليل لتوفير تلطيخ متساو ومتسق في جميع أنحاء الأقسام.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية داخل البشرة البشرية. تم تصميم بروتوكولنا التفصيلي لتعليم الباحثين الآخرين كيفية تلطيخ خزعات جلد الإنسان وتصويرها ومعالجتها وتحليلها بهدف فهم الآليات الكامنة وراء التسبب في الأمراض العصبية القائمة على الميتوكوندريا مثل الاعتلال العصبي.