حل الحيوي النووية الاستقطاب الأجهزة لفي الوقت الحقيقي القياسات الأنزيمية ردود الفعل قيم وNMR

الهدف العام من هذه التجربة هو متابعة العمليات الأنزيمية في الوقت الفعلي عن طريق الاستقطاب النووي الديناميكي والرنين المغناطيسي النووي المعزز. يمكن أن يساعد الرنين المغناطيسي في الحالة السائلة المعزز بالاستقطاب النووي الديناميكي ، DNP ، في الإجابة على الأسئلة الرئيسية: كيفية تحديد ، على سبيل المثال ، معدلات التحول الأنزيمي لزوج من الجزيئات في الخلية أو في الجسم الحي دون الحاجة إلى تغيير هذا الزوج من الجزيئات بأي شكل من الأشكال. يعد تركيب معدات DNP القابلة للذوبان في مختبرنا ووصول الدكتور ريكاردو بالزان ، حاصل على درجة الدكتوراه في مختبر Arnaud Comment في لوزان ، خطوة كبيرة إلى الأمام لأبحاثنا.

يزيد DNP بشكل كبير من حساسية التجارب التي يمكننا إجراؤها على مطياف الرنين المغناطيسي النووي 500 ميجاهرتز. كانت معدات DNP هذه هي أول جهاز يتم تركيبه في فرنسا وأود أن أذكر أنه في جعل هذه المعدات وظيفية ، شارك جميع أعضاء فريق الرنين المغناطيسي النووي لدينا وأود أن أذكر على وجه الخصوص جيلداس بيرتو ، مهندس الأبحاث لدينا ، وفاتحة كاتب ، مديرة مؤتمراتنا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس الكمي المباشر في الوقت الفعلي للركيزة ومشتقاتها الداخلية بدقة زمنية قدرها الثواني.

بالنسبة لمحلول الاستقطاب ، قم بإعداد ملليلترين من محلول بيروفات الصوديوم المسمى 1.12 مولار ، الكربون 13 المخدر ب 33 ملليمولار من جذر TEMPO في حجم اثنين إلى واحد من الماء المنزوع للإيثانول المنزوع لملاحظات الكربون 13. قم بخفض درجة حرارة الاستقطاب النووي الديناميكي ، أو DNP ، من خلال إجراء التهدئة بالنقر فوق زر التهدئة على واجهة برنامج ناظم البرد. اجمع الهيليوم السائل في ناظم البرد DNP من خلال إجراء التعبئة.

انقر فوق زر التعبئة على واجهة برنامج cryostat. ثم ضع 300 ميكرولتر من محلول الاستقطاب المحسن في حاوية العينة المزودة بمستقطب DNP. قم بتجميد حاوية العينة مع العينة بداخلها عن طريق غمرها برفق في حمام النيتروجين السائل.

تخلص من النيتروجين السائل الذي قد يكون موجودا في حاوية العينة بعد إجراء التجميد عن طريق استخراج حاوية العينة من حمام النيتروجين السائل وتدويرها رأسا على عقب. بعد ذلك ، أدخل العينة في ناظم البرد عن طريق إدخال حاوية العينة أولا في حامل العينة. ثم ضع حامل العينة في ملحق ناظم البرد الرئيسي قبل إدخال موجه موجة الميكروويف في حامل العينة.

اخفض درجة حرارة ناظم البرد عن طريق بدء إجراء تبريد كلفن واحد. انقر فوق زر تبريد كلفن على واجهة برنامج ناظم البرد. قم بتشغيل مصدر الميكروويف وإشعاع العينة بالنقر فوق زر تشغيل أفران الميكروويف على واجهة برنامج cryostat.

افصل الكبل المحوري لقناة الكشف عن وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي من ملف مقياس الطيف عن طريق تدوير الموصل عكس اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة وسحبه. قم بتوصيل الكبل المحوري لقناة الكشف بالموصل المحوري لملف الرنين المغناطيسي النووي الناجم. ثم أدخل الموصل الذكر لكابل وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي في الموصل الأنثوي لملف الرنين المغناطيسي النووي الناجم عن البرد ، مع الانتباه إلى دبوس الاتجاه.

ادفع الموصل بقوة وقم بتدويره في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة. قم بقياس الإشارة الحرارية للرنين المغناطيسي النووي في الحالة الصلبة في موقع ناظم البرد باستخدام تسلسل بسيط لاكتساب النبض مع نبضات بزاوية قلب منخفضة غير معايرة تتكرر بفاصل زمني t يساوي خمس دقائق. بعد إعداد القياس ، اكتب zg في سطر الأوامر بالبرنامج واضغط على Enter على لوحة المفاتيح.

بعد بدء إجراء الاستقطاب ، قم بقياس إشارة الرنين المغناطيسي النووي المحسنة DNP في الحالة الصلبة بنفس الإجراء والشروط المستخدمة لقياس الإشارة الحرارية. افصل الكبل المحوري لقناة الكشف عن وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي عن ملف الرنين المغناطيسي النووي ناتج عن طريق تدوير الموصل عكس اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة وسحبه. ثم قم بتوصيل الكبل المحوري لقناة الكشف بالموصل المحوري لملف مقياس الطيف.

أدخل الموصل الذكر لكابل وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي في الموصل الأنثوي لملف مقياس الطيف ، مع الانتباه إلى دبوس الاتجاه. ادفع الموصل بقوة وقم بتدويره في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة. تحضير محلول LDH لعضلة الأرانب حديثا بوحدة واحدة لكل مليلتر في عازلة التفاعل مع 20 ميكروغرام لكل مليلتر من ألبومين مصل الأبقار.

بعد ذلك ، امزج 478 ميكرولتر من محلول التفاعل ، و 2 ميكرولتر من محلول LDH ، و 20 ميكرولترا من الماء المنزوع للسماح بتثبيت مجال مقياس الطيف ، أو القفل. ثم ضع حجم محلول 500 ميكرولتر في أنبوب رنين مغناطيسي 5 ملم. قم بتوصيل أنبوب النقل بجهاز حقن آلي مخصص يفصل المحلول شديد الاستقطاب عن غاز الهيليوم المستخدم في النقل.

يوفر الجهاز تلقائيا 500 ميكرولتر من محلول مفرط الاستقطاب في أنبوب العينة. قبل الذوبان ، ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي المكون من خمسة ملليمترات الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من العينة في مركز متساوي مطياف الرنين المغناطيسي النووي 11.74 تسلا. أدخل 5 مل من الماء المنزوع في غلاية إدراج الذوبان.

قم بالضغط على الماء المنزوع وتسخينه عن طريق السلك المقاوم حتى تصل درجة الحرارة إلى حوالي 180 إلى 200 درجة مئوية بالنقر فوق زر إعداد السخان على واجهة برنامج ناظم البرد. انقر فوق SS Operations زر على واجهة برنامج cryostat. ثم قم بإزالة دليل الميكروويف من ملحق الذوبان.

حرك ملحق الذوبان لأسفل في حامل العينة. يجب أن يصل ملحق الذوبان إلى الجزء السفلي من حامل العينة ويجب دفعه بقوة لإجراء اتصال محكم للتسرب بحاوية العينة لتجنب تسرب المياه المنزوعة إلى ناظم البرد. اضغط على مشغل الجهاز لبدء تسلسل الذوبان، وهو تسلسل محدد مسبقا في الوقت المناسب لعمليات الصمامات الهوائية.

بعد الذوبان مباشرة ، يمزج جهاز الحقن 500 ميكرولتر من محلول مفرط الاستقطاب مع العينة الموضوعة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي. بعد الذوبان ، قم بقياس إشارة الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب من العينة في مقياس الطيف بسلسلة من 10 درجات ، وتسلسلات اكتساب نبض بزاوية الوجه متباعدة بمقدار 1.5 ثانية لمتابعة تقدم مغنطة الركيزة والمنتج. بعد إعداد القياس ، اكتب zg في سطر الأوامر بالبرنامج واضغط على Enter.

بمجرد استرخاء المغنطة تماما ، قم بقياس الإشارة الحرارية بالرنين المغناطيسي النووي بسلسلة من تسلسلات اكتساب النبض بزاوية 90 درجة متباعدة بحوالي ثلاث دقائق ، أي ما يعادل حوالي 3T1. بعد إعداد القياس ، اكتب zg في سطر أوامر البرنامج اضغط على مفتاح الإدخال. هنا يظهر المسار الزمني للأطياف التي تم الحصول عليها من نبضات زاوية الوجه المتكررة بزاوية 10 درجات الحساسية والدقة الزمنية للتقنية.

بعد تحديد ذروة ركيزة البيروفات ومنتج اللاكتات ، يتم إجراء القياس الكمي من خلال تكامل إشارة المستقلبات. يتم تحديد النشاط الأنزيمي من المسار الزمني لإشارة المنتج من خلال الملاءمة لنموذج خطي. للتحقق من صحة القياس ، يتم تقييم نفس الكمية من خلال معدل التفاعل الأولي ، من نسبة إشارات المنتج والركيزة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء قياس كامل للنشاط الأنزيمي في غضون ساعتين تقريبا إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية إنتاج ركيزة شديدة الاستقطاب للرنين المغناطيسي النووي ، وحقنها في محلول يحتوي على إنزيم ، ومتابعة النشاط الأنزيمي باستخدام الرنين المغناطيسي النووي المحسن DNP. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحضير المحلول الأنزيمي بعناية باستخدام إنزيم جديد وركائز مساعدة ، وتجنب أي فقاعة هواء في أنبوب العينة.

مع تطوير الرنين المغناطيسي المعزز DNP في الحالة السائلة ، يمكن للباحثين الآن استكشاف امتصاص الركيزة وتحولها الأنزيمي داخل أنواع مختلفة من الخلايا عن طريق قياس معدل تكوين المنتج. لا تنس أن العمل مع المعدات المبردة والمجالات المغناطيسية العالية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء الحماية الشخصية ضد المبردات والتحقق من عدم وجود أجسام مغناطيسية أثناء إجراء هذه القياسات.

على عكس الرنين المغناطيسي النووي الكلاسيكي ، يقتصر الرنين المغناطيسي النووي المستند إلى DNP على نافذة زمنية تجريبية من الدقائق على الأكثر ، اعتمادا على الركيزة والحالة الحالية للحياة. هذا يقف في طريق تجاوز التحليل الطيفي D واحد. يحتاج الرنين المغناطيسي النووي DNP الذوبان إلى التطوير ليصل إلى مستوى تعدد استخدامات الرنين المغناطيسي النووي الكلاسيكي متعدد الأبعاد.