طريقة سريعة وفعالة لتنقية خلايا الأديم المولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

الهدف العام من هذه الطريقة هو تنقية خلايا الأديم الباطن المتولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية الجنينية الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية حول تمايز الأديم الباطن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على مجموعة خلايا الأديم الباطن النقية بعد إزالة الخلايا غير المتمايزة.

قبل البدء في الإجراء ، قم بتغطية ستة ألواح لزراعة خلايا البئر بمليلتر واحد من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر. لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، لحصاد الخلايا الجذعية الجذعية البشرية ، قم بشفط الوسط من 80 إلى 90٪ من زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام ماصة مراعي زجاجية معقمة.

واغسل الخلايا بملليلترين من PBS لكل بئر. هز اللوحة وشفط المحلول الملحي لإزالة الخلايا الميتة والحطام. بعد ذلك ، قم بفصل مجموعات الخلايا برفق مع مليلتر واحد من كاشف محلول المرور الخالي من الإنزيم ، عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تظهر الخلايا علامات واضحة على الاضطراب في مجموعات أصغر.

بعد حوالي سبع دقائق ، أضف ملليلتر واحد من وسط DMMF12 إلى الآبار. وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد لفصل مجاميع الخلايا المتبقية في معلق خلية واحدة. باستخدام نفس الماصة ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي واشطف الآبار بمليلتر واحد من وسط DMMF12 الطازج ، وتجميع الغسالات في الأنبوب.

بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية المكمل بمثبط ROCK. عد الخلايا والبذور 1.5: 4 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر على الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي في وسط الاستزراع المكملة بمثبط ROCK لمنع موت الخلايا المبرمج. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة تقريبا.

ثم استخدم ماصة باستور زجاجية معقمة لاستبدال الوسط في كل بئر ب 2 مل من وسط تحريض الخط البدائي. بعد 24 ساعة أخرى من الثقافة ، استبدل الوسط بوسط تحريض الأديم الباطن لمدة 48 ساعة مع تغييرات متوسطة يومية. في اليوم الأخير من الاستزراع وقبل ساعة واحدة على الأقل من حصاد الخلايا ، أضف مثبط ROCK الطازج إلى وسط الاستزراع.

ثم استخدم ماصة باستور زجاجية معقمة لشفط الوسط من كل بئر وفصل الخلايا بكاشف محلول مرور خال من الإنزيم كما هو موضح للتو. عندما يتم تحقيق تعليق أحادي الخلية ، قم بحساب الخلايا وطردها المركزي. تأكد من أنه من هذه النقطة فصاعدا ، تحتوي جميع الوسائط والمخازن المؤقتة على مثبط ROCK لمنع الخلايا من الموت.

خلاف ذلك ، لن يتم إرفاقها بشكل صحيح بعد الانحسار. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PEB ، مع استكمال مثبط ROCK لكل 1 في 1 في 10 إلى الخلايا السابعة. ثم أضف الجسم المضاد CXCR4 APC إلى الخلايا.

بنفض الأنبوب برفق للخلط. بعد 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، اغسل الخلايا في واحد إلى ملليلتر إلى ملليلترين من محلول PEB واستخدم ماصة باستور زجاجية معقمة لشفط المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت PEB لكل 1 في 10 إلى الخلايا السابعة وأضف 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة ل APC إلى الخلايا.

امزج العينة بنقرة لطيفة. ثم احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بواحد إلى ملليلتر من محلول PEB المكمل بمثبط ROCK.

وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مثبط PEB الطازج بالإضافة إلى المثبط. لعزل خلايا CXCR4 + عن طريق فصل الخرزة المغناطيسية ، قم بتحميل عمود مغناطيسي متوسط الحجم على مغناطيس بحجم مناسب واشطف العمود مسبقا بمخزن مؤقت PEB سعة 500 ميكرولتر بالإضافة إلى مثبط ROCK. عندما يتم تصريف كل الغسيل من أعلى العمود ، قم بتطبيق حجم الخلية المسمى بالخرزة المغناطيسية بالكامل على العمود ، وجمع التدفق في أنبوب مخروطي الشكل.

اغسل العمود بثلاثة تطبيقات من 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PEB بالإضافة إلى مثبط ROCK. ثم انقل العمود من المغناطيس إلى أنبوب تجميع مناسب. واغمر ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت PEB بالإضافة إلى مثبط ROCK عبر العمود لجمع خلايا CXCR4 +.

اختياريا ، يمكن جمع كل التدفق عبر العينات بشكل منفصل ويمكن استخدام 20 ميكرولتر من كل عينة لتحديد النسبة المئوية لخلايا CXCR4 + في كل ألويت عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن تكرار هذا الإجراء مع التدفق الأول لتجميع الخلايا التي لم ترتبط بالعمود. ثم قم بتجميع كل من عينات CXCR4 + وقم بطردها المركزي.

أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط تحريض الأديم الباطن المكملة بمثبط ROCK وبذر الخلايا بالكثافة المناسبة في حاوية زراعة الخلايا المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي. قبل تمايزها ، تعبر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن مستويات عالية من علامة تعدد القدرات SOX2. في حين لم يتم اكتشاف علامة الأديم الباطن النهائية ، FOXA2.

عند التمايز ، تخضع الخلايا الجذعية الجنينية لتغييرات جذرية في تعبيرها الجيني والبروتيني. في الواقع ، بعد أربعة أيام في وسط التمايز ، يتم التعبير عن SOX17 و FOXA2 بشكل موحد داخل نوى العديد من الخلايا الجذعية الجنينية السابقة ، وهي سمة مميزة لالتزام الأديم الباطن النهائي. تقاوم بعض الخلايا عملية التمايز ، ولا تعبر عن أي من بروتيني العلامات.

وفي الواقع ، احتفظ بتعبير SOX2 الخاص بعلامة تعدد القدرات. في هذه التجربة التمثيلية ، في اليوم الثالث من التمايز ، عبر ما يقرب من 60٪ من الخلايا الجذعية الجذعية المحصودة عن CXCR4 ، والتي تم إثراء نقاوتها إلى أكثر من 85٪ بعد فرز الخرزة المغناطيسية لخلايا النسب متعددة القدرات وغيرها من خلايا النسب غير المرغوب فيها. بعد بذر خلايا CXCR4 + المنقاة ، يتم اكتشاف عدد قليل فقط من خلايا SOX2 + ، حيث تعبر غالبية الخلايا المصنفة عن FOXA2.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء كيمياء نسيجية مناعية أخرى أو QPCR للإجابة على أسئلة إضافية حول عملية التمايز. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية خلايا الأديم الباطن عن طريق فرز الخرز المغناطيسي.