وساطة من HSV-التعبير التحوير من همي التركيبات لدراسة وظيفة السلوكية من هذه العملية من Heteromers في الفئران

الهدف العام لهذه الطريقة هو ملاحظة كيفية تأثير نقل الجينات بوساطة الفيروس على الأنماط الظاهرية السلوكية التي تتطلب تغايرة المستقبلات المقترنة ببروتين G في نماذج الفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأدوية العصبية والنفسية. على وجه التحديد كيف تتفاعل المستقبلات المقترنة ببروتين g مع بعضها البعض على المستوى الجزيئي.

باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا أن نفهم كيف يؤثر هذا التفاعل على السلوك في نماذج الاضطرابات النفسية ، مثل الفصام والاكتئاب. باستخدام هذه الطريقة ، سننظر على وجه التحديد إلى السيراتونين 2a ومستقبلات الغلوتامات الأيضية 2 ، وكلاهما ثبت أنه متورط في آلية عمل الأدوية المستخدمة لعلاج مرضى الفصام. ابدأ بتخدير الماوس بشكل صحيح وفقا للطرق المعتمدة.

تأكد من الحصول على مستوى جراحي للتخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم وملاحظة عدم وجود استجابة. ثم ضع جل العيون لحماية العينين. قم بتوصيل الماوس بالإطار التجسيمي ، مع التأكد من ضبط إمالة الرأس بحيث تكون الجمجمة مستوية ومسطحة.

ضع بوفيدون اليود على فروة الرأس المكشوفة. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق سهمي على طول خط الوسط للجمجمة داخل المنطقة المحلوقة المكشوفة. ثم قم بتوصيل المشابك النقية بالجلد في موقع الشق للتأكد من بقاء الجمجمة مكشوفة.

ضع بيروكسيد الهيدروجين لإذابة السمحاق وفضح خيوط الجمجمة. الآن بعد أن أصبحت البريجما والخيوط مرئية ، تأكد من ضبط الإطار التجسيمي للتأكد من أن الجمجمة مستوية. قم بمحاذاة أطراف إبرة المحاقن مع بريجما وسجل إحداثيات بريجما.

لحقن القشرة الأمامية ثنائيا ، أضف 1.6 مم إلى إحداثيات بريجما الذيلية المنقارية المسجلة ، و 2.6 مم إلى إحداثيات بريجما الجانبية الإنسية المسجلة. ضع علامة على مواقع الحقن على الجمجمة ثم حفر ثقوب صغيرة في مواقع الحقن. باستخدام قضيب قطني ، امسح أي دم زائد أو شظايا عظام.

أحضر الإبرة إلى سطح الدماغ ، وخفضها إلى عمق الإحداثيات البطنية الظهرية. ثم قم بحقن محتويات المحقنة ببطء عن طريق لف مكبس الإبرة لإدارة 0.1 ميكرولتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، لحقن 0.5 ميكرولتر. اترك المحقنة في مكانها لمدة خمس دقائق.

بعد الوقت المخصص ، قم بإزالة من التجسمية ، وأغلق الشق ، وضعه على وسادة تسخين. قم بإعطاء تسكين ما بعد الجراحة وفقا لبروتوكول المعتمد الخاص بك. إجراء الاختبارات السلوكية بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحقن التجسيمي للجزيئات الفيروسية.

اعتاد الفئران على الذهاب إلى الغرفة لمدة أربع ساعات على الأقل قبل بدء التجربة. ابدأ بإذابة DOI في محلول ملحي بنسبة 0.9 في المائة إلى ملليغرامين لكل كيلوغرام. قم بإعداد قفص منزلي بدون أي فراش وباستخدام حامل ثلاثي القوائم ، اضبط الكاميرا بحيث تكون فوق قفص المنزل مباشرة.

بمعايرة الكاميرا بحيث يكون قفص المنزل بأكمله في مجال الرؤية. قم بوزن الفأر وحقنه داخل الصفاق بالجرعة المناسبة إما 0.9 في المائة من محلول ملحي أو DOI. ضع الماوس مرة أخرى في قفص المنزل لمدة عشر دقائق.

بعد عشر دقائق ، ضع الماوس في وسط قفص المنزل الفارغ ، وتأكد من عدم وجود نقاط عمياء في مجال رؤية الكاميرا. اضغط على التسجيل على كاميرا الفيديو واترك الغرفة. بعد 30 دقيقة ، أوقف التسجيل وأعد الماوس إلى قفص المنزل الأصلي.

كرر الاختبار السلوكي على الماوس التالي. اطلب من الحكم مراجعة مقاطع الفيديو أعمى عن الظروف التجريبية. سجل يدويا كل ارتعاش في الرأس طوال الفيديو.

يعرف ارتعاش الرأس بأنه حركة اهتزاز سريع للرأس يقوم به الفأر. قم بمعالجة البيانات كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول. تظهر هنا صورة تمثيلية للتعبير الجيني المعدل بوساطة فيروس الهربس البسيط في القشرة الأمامية.

حقن HSV mGlu2 GFP في القشرة الأمامية وتم الكشف عن تعبير GFP بواسطة الكيمياء المناعية. يمثل شريط المقياس هذا 200 ميكرون. تظهر هذه الصورة لطخة غربية من التعبير الجيني المعدل بوساطة فيروس الهربس البسيط والتفاعل المضاد ل mGlu2 في القشرة الأمامية للفئران بالضربة القاضية mGlu2.

قمنا هنا بقياس النشاط المناعي ل mGlu2 كمونومر. يوضح هذا الرسم البياني أن التعبير الفيروسي بوساطة mGlu2 ، ولكن ليس عن mGlu2 الخيمري في القشرة الأمامية للفئران بالضربة القاضية mGlu2 ينقذ بشكل كبير استجابة ارتعاش الرأس الناجمة عن ناهض مستقبلات السيراتونين 2a المهلوس. أهم الخطوات في هذه التجربة هي التوقيت بين الحقن الفيروسية ، واستجابة ارتعاش الرأس ، ووقت التضحية بالفئران.

يمكن لأي تأخير أن يغير نتائج التجربة أو يدخل غموضا في البيانات. بمجرد إتقانها ، ستستغرق جراحة الفأر حوالي 30 دقيقة لحقن الفيروس. يجب أن تستغرق تجربة ارتعاش الرأس أيضا حوالي 35 دقيقة لكل فأرة.

يوصى بإجراء عمليات جراحية مذهلة أو إجراء عمليات جراحية على أكثر من فأرة واحدة في وقت واحد. بهذه الطريقة يمكن للمرء أن يحافظ على جدول زمني يسمح بإجراء تجارب ارتعاش الرأس في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام بعد الجراحة وهو وقت ذروة التعبير عن الهيكل الفيروسي. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.