من خلال المرآة: المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية من الخلايا واحدة لدراسة العلاج المضادة للسرطان
مايو 14, 2016
هنا ، نصف طريقة للفحص المجهري طويل المدى لتتبع الخلايا المفردة طوليا استجابة للعلاجات المضادة للسرطان.
الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة الاستجابة العلاجية المضادة للسرطان في الخلايا المفردة في الثقافة. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث السرطان ، بما في ذلك الاستجابة العلاجية غير المتجانسة ومصير الخلية. للبدء ، تحت غطاء تدفق رقائقي معقم معتمد ، قم بإعداد خلايا HT1080 في أطباق معتمدة من الثقافة وفقا لبروتوكول النص واحتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة.
قبل يومين من التصوير ، لوحة 50،000 HT1080 خلية FuGENE لكل بئر في العدد المطلوب من الآبار من طبق ذو قاع زجاجي مكون من 12 بئرا ، رقم 1.5. اضبط عدد الخلايا المطلية اعتمادا على معدل نموها والطبق المستخدم من أجل تحقيق ما يقرب من 60٪ التقاء لبدء التجربة.
قم بإعداد الغرفة البيئية على رطوبة 80٪ تقريبا مع ضبط درجة الحرارة في موضع العينة على 37 درجة مئوية. تأكد من ملء خزان المياه بالماء المقطر المعقم باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ثم قم بتشغيل الغرفة البيئية إلى إعداد درجة الحرارة المطلوب ، وضعها في مرحلة المجهر واضبطها.
إذا كان هناك أي مساحة خالية بين الغرفة العلوية للمسرح والجزء الداخلي من المسرح ، فضع قطعا من فيلم البارافين على حواف فتحة المسرح الداخلية ، قبل إدخال الغرفة فيها ، لإقران الغرفة بالمسرح. تأكد من عدم وجود وصلات تسحب الغرفة ، وكلاهما يمكن أن يقدم القطع الأثرية للحركة. أدخل طبقا وهميا بالماء في الغرفة ، واترك الغرفة تتوازن إلى 37 درجة مئوية ثم حافظ على درجة حرارة ثابتة.
لإعداد التصوير، قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر وأي أجهزة طرفية مطلوبة. اعتمادا على مصدر الضوء ، انتظر لتشغيله لحين الحاجة. مع وجود البرج الموضوعي في موضع منخفض، حدد هدف فتحة العدسة الرقمية 20x 0.7.
ثم ضع العينة فوق الهدف ، مما يسهل العثور على الخلايا عندما تكون العينة في الغرفة. بعد نقل الخلايا المراد تصويرها إلى الغرفة البيئية ، وفقا لبروتوكول النص ، أغلق الغرفة للحفاظ على بيئة مستقرة وقم بتشغيل الغاز الجوي. بعد ذلك ، حدد ظروف التصوير التي ستمنع سمية الصورة عن طريق الحد من أوقات التعرض واستخدام ضوء أقل كثافة.
للعثور على مستويات X و Y و Z والأطوال الموجية المطلوبة لكل موضع يتم تصويره. للفاصل الزمني طويل المدى لمعظم العمليات الخلوية ، احصل على صورة واحدة كل عشر إلى عشرين دقيقة. توفر دقة الوقت الأكبر المزيد من نقاط البيانات وتتبعا أكثر قوة للخلايا ولكنها تؤدي إلى تعرض أكثر تكاملا للضوء ومجموعات بيانات أكبر.
نظرا لأن HT1080 FuGENE يحتوي على بروتينات فلورسنت ديناميكية خضراء وحمراء ، استخدم أوقات التعرض التالية واستخدم سلة اثنين في اثنين. ضمن الإعدادات المتقدمة، قم بتمكين التركيز البؤري التلقائي الذي يتم التحكم فيه بواسطة البرامج باستخدام الإعدادات الافتراضية. حدد نطاق تركيز بؤري تلقائي يبلغ 10 ميكرومتر بحجم الخطوة الموصى به.
في الطبق التجريبي ، لتقليل الانجراف الحراري ، استبدل نصف الوسط بوسط يحتوي على الدواء المطلوب الذي تم تسخينه إلى 37 درجة مئوية. أخيرا ، ابدأ الفاصل الزمني واحصل على الصور وفقا لبروتوكول النص. تعرض هذه الأفلام أمثلة على زوج من خطوط خلايا MCF7 المشتقة من سرطان الثدي والتي تختلف فقط في حالة p53 التي تم علاجها بدواء مضاد للسرطان يثبط كينيسين 5 مما يؤدي إلى توقف الانقسام.
كما هو موضح في هذا الشكل ، عندما تتم إزالة p53 عن طريق ضربة قاضية مستقرة p53 ، بدلا من القبض عليها بعد مغادرتها الانقسام ، تمر الخلايا بدورات متكررة حيث تدخل جولة ثانية من الانقسام بدلا من الاعتقال ، وتترك الانقسام دون انقسام. تظهر هنا خلايا هيلا المشتقة من سرطان عنق الرحم التي تعبر بثبات عن علامة الكروماتين هيستون 2 ب المدمجة في mCherry وبيتا توبولين مدمج في EGFP. عند معالجتها بعقار تثبيت الأنابيب الدقيقة باكليتاكسول ، تتعطل محاذاة الكروموسوم وفصلها أثناء الانقسام ، مما يؤدي إلى تكوين انتفاخات نووية ونوى دقيقة معرضة لتلف الحمض النووي.
يشارك خط الخلية هذا بثبات في التعبير عن مؤشري دورة خلية اليوبيكويتين الفلوريسنتية ل CDT1 ، باللون البرتقالي ، والجيمينين باللون الأخضر ، ويتقدم خلال دورة الخلية بشكل طبيعي. عندما يتم التعامل مع نفس الخلايا بمثبط CDK46 ، تتقدم الخلايا خلال مرحلة G2 وتنقسم بشكل طبيعي ثم تتوقف بقوة في مرحلة G1 مما يشير إلى احتمال حدوث تأثيرات تثبيط خلوي عاطفي في الأورام النامية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك متابعة استجابة خلية واحدة ، مباشرة ، في الوقت الفعلي على مدار عدة أيام بدلا من استنتاج تلك الاستجابات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة للتصوير المجهري بنظام الفاصل الزمني طويل الأمد لتتبع استجابات الخلايا المفردة للعلاجات المضادة للسرطان. تتيح هذه التقنية للباحثين مراقبة الاستجابات العلاجية غير المتجانسة ومصير الخلايا في الوقت الفعلي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث السرطان
خلفية علمية
- يعد فهم استجابات الخلايا للأدوية المضادة للسرطان أمراً بالغ الأهمية لعلاج السرطان.
- يوفر تحليل الخلية الواحدة رؤى حول التباين الخلوي.
- يتيح المجهر بنظام التصوير الزمني (Time-lapse microscopy) مراقبة العمليات الخلوية الديناميكية.
- تُستخدم الخطوط الخلوية HT1080 و HeLa بشكل شائع في أبحاث السرطان.
الغرض من الدراسة
- لملاحظة تأثيرات العلاجات المضادة للسرطان على الخلايا الفردية.
- لاستقصاء الآليات الكامنة وراء الاستجابات العلاجية المتفاوتة.
- لتوفير طريقة للتصوير طويل الأمد لسلوك الخلايا.
الطرق المستخدمة
- تحضير خلايا HT1080 في أطباق الزرع.
- إعداد غرفة بيئية لضمان استقرار ظروف التصوير.
- استخدام المجهر بنظام التصوير الزمني (time-lapse microscopy) لرصد الاستجابات الخلوية بمرور الوقت.
- استخدام العلامات الفلورية لتصوير العمليات الخلوية.
النتائج الرئيسية
- أظهرت الخلايا التي خضعت لتقليل تعبير p53 سلوكاً انقسامياً غير طبيعي.
- أدى العلاج بـ Paclitaxel إلى تعطيل اصطفاف الكروموسومات في خلايا HeLa.
- أظهر العلاج بمثبط CDK46 تأثيرات محتملة كابحة لنمو الخلايا.
- وفر التتبع في الوقت الفعلي رؤى حول استجابات الخلية الواحدة.
الاستنتاجات
- تتيح هذه الطريقة الملاحظة التفصيلية لاستجابات الخلايا المفردة للأدوية.
- يمكن للتصوير في الوقت الفعلي أن يكشف عن رؤى بالغة الأهمية حول سلوك الخلايا السرطانية.
- يعزز هذا النهج من فهم الفعالية العلاجية والمقاومة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج التتبع الطولي للخلايا المفردة فجوة حرجة في تطوير أدوية الأورام من خلال الكشف عن الاستجابات العلاجية غير المتجانسة التي تحجبها المقايسات القائمة على المجموعات السكانية. وتعزز هذه القدرة الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف وتحديد المركبات الرائدة من خلال تمكين الملاحظة المباشرة لقرارات مصير الخلية، وديناميكيات المسارات، وآليات المقاومة على فترات زمنية ممتدة. وتدعم هذه الطريقة تقليل المخاطر الميكانيكية والاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى المراحل قبل السريرية، مما يوجه قرارات فرز المحافظ الدوائية وقرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال الملاحظة المباشرة للاستجابات غير المتجانسة للمركبات المضادة للسرطان في نماذج خلوية متماثلة جينياً.
- القيمة التشغيلية: توضح التأثيرات المحددة للمسارات، مثل التوقف في الطور الانقسامي، أو التوقف في طور G1، أو تحفيز تلف DNA، من خلال قراءات المستشعرات الحيوية في الوقت الفعلي.
- القيمة الانتقالية: تدعم مواءمة المؤشرات الحيوية من خلال ربط ديناميكيات المراسل الفلوري (مثل الدورة الخلوية، والموت الخلوي المبرمج) بالنتائج الوظيفية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولد بيانات كمية قياسية لسلاسل زمنية حول التكاثر، وتطور الدورة الخلوية، والتمركز تحت الخلوي لغرض فحص المركبات.
- قابلية التكرار: يعمل استقرار الغرفة البيئية على تقليل الانجراف والشوائب، مما يسمح بإجراء قياسات طولية متسقة عبر المكررات.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع تنسيقات الآبار المتعددة والتحكم الآلي في التركيز، مما يدعم حملات الفحص المظهري متوسطة الإنتاجية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: ينمذج سياقات السرطان البشري باستخدام خطوط HT1080 (الساركوما الليفية) وHeLa (سرطان عنق الرحم) مع اضطرابات جينية محددة.
- تقليل المخاطر الآلية: يفرق بين التأثيرات المثبطة للخلايا والتأثيرات السامة للخلايا، ويحدد إعادة الدخول الشاذة في الدورة الخلوية كآلية للمقاومة.
- الاستمرارية قبل السريرية: يوفر جسراً يربط بين أنماط الارتباط بالهدف والنتائج الوظيفية لمصير الخلايا ضمن إطار زمني ذو صلة فسيولوجياً.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركب الرائد، حيث تساهم القراءات المظهرية الديناميكية في توضيح علاقات البنية بالنشاط وتحديد ملفات الانتقائية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تختبر الفرضيات المستهدفة من خلال ربط التعرض للدواء بالتغيرات اللحظية في التكاثر، وديناميكيات الكروموسومات، وإشارات الموت الخلوي المبرمج.
- الفحص المسحي: توفر مخرجات عالية المحتوى ومحددة زمنياً، مما يجعلها مناسبة لتقييم تأثيرات المركبات على المجموعات الخلوية غير المتجانسة.
- التحليلات: تتيح استخراج المعلمات الحركية (مثل مدة التوقف، وتكرار إعادة الدخول في الدورة الخلوية) التي تدعم التصنيف المقارن للمركبات.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الأنماط الظاهرية في المختبر بالمؤشرات الحيوية السريرية للاستجابة والمقاومة من خلال مراسلين محددين للمسارات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام وتطبيقها عبر مختلف دواعي الاستعمال في علم الأورام وفئات الأهداف العلاجية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تقليل الغموض الميكانيكي من خلال رصد الاستجابات العابرة، أو النادرة، أو المتأخرة التي لا تظهر في مقايسات النهاية النهائية.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير التصوير طويل الأمد للخلايا الحية تحت ظروف مضبوطة، مما يحسن اتساق البيانات بين الفرق المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال الكشف المبكر عن آليات المسؤولية مثل الانزلاق الانقسامي أو المقاومة التكيفية.
- التأثير على المحفظة: تمكين تحديد أولويات المركبات بناءً على المخاطر، استناداً إلى ملفات استجابة الخلية الواحدة ومدى ديمومة التأثير.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التصوير الحي للخلايا، والتحكم البيئي، والتحقق من صحة المستشعرات الحيوية الفلورية.
- يعتمد على أنظمة الحضن فوق المنصة، وأجهزة تصحيح الانزياح، وكاميرات عالية الحساسية.
- يستلزم إجراءات تشغيل معيارية لموازنة الغرفة، وتبديل الوسط، والحفاظ على التركيز البؤري.
- تشمل اعتبارات التكيف إدارة السمية الضوئية، والتداخل الطيفي للمستشعرات الحيوية، وكثافات الزرع الخاصة بكل خط خلوي.
- تشمل القيود العملية متطلبات تخزين البيانات وتعقيد التحليل للتتبع طويل الأمد ومتعدد المعلمات.
![السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55709.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.958Z&w=384&q=75)
