جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية

الهدف العام من هذه التقنية هو الفحص السريع للأجسام المضادة الذاتية بطريقة متعددة الإرسال. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة الذاتية ، مثل الأجسام المضادة الذاتية المرتبطة بحالات المرض المختلفة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن فحص الأجسام المضادة الذاتية بطريقة متوازية ، وهناك حاجة فقط إلى ميكرولتر من المصل ، وهناك حاجة فقط إلى ميكروغرام من المستضد.

لتوليد المصفوفات الدقيقة للمستضد ، ابدأ بتخفيف المستضدات في PBS إلى تركيز نهائي قدره 2 ملليغرام لكل مليلتر. قم بإعداد تكوين صفيف صغير مع تسعة دبابيس لطباعة ما يصل إلى 162 مستضدا فريدا في نسختين. قم بتضمين مستضدات IgG و IgM في مكتبة المستضدات كعناصر تحكم إيجابية.

قم بتضمين PBS فقط كعنصر تحكم سلبي. أضف 20 ميكرولترا من كل مستضد إلى لوحة مصدر البئر 384 في مجموعات تعكس إعداد رأس الطباعة. استخدم رقائق معدنية لتغطية لوحة المصدر ، وقم بتجميد اللوحة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، حتى تصبح جاهزة لطباعة المصفوفات.

قم بتنظيف دبابيس المصفوفات الدقيقة الصلبة عن طريق احتضانها في حمام صوتنة بالماء منزوع الأيونات ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منهما. ضع المسامير في الرف حتى تجف. ثم رتب المسامير في رأس طباعة المصفوفة الدقيقة.

لتسعة دبابيس ، استخدم تكوينا ثلاثة في ثلاثة. بعد ذلك ، قم ببرمجة المصفوفة الدقيقة لتشغيل الطباعة عن طريق تعيين عدد المسامير على رأس الطباعة ، وعدد الشرائح المراد طباعتها ، وعدد الوسادات الموجودة في كل شريحة ، وعدد البقع المتماثلة لكل مستضد. بالإضافة إلى ذلك ، قم ببرمجة المصفوفة الدقيقة لصوتنة المسامير في الماء بين مجموعات مختلفة من المستضدات.

بعد ذلك ، بعد إذابة لوحة المصدر ، قم بطردها لمدة دقيقة واحدة عند 100 مرة G.ضع لوحة المصدر في المكان المحدد في المصفوفة الدقيقة ، ثم قم بإزالة قسم الرقاقة الذي يغطي المجموعة الأولى من المستضدات المراد طباعتها. رتب الشرائح غير المطبوعة على سطح المصفوفة وقم بتشغيل برنامج الطباعة. اطبع الشرائح في درجة حرارة الغرفة مع ضبط الرطوبة على المصفوفة عند 55 إلى 60٪ بعد طباعة كل مجموعة من المستضدات على جميع الشرائح، أوقف المصفوفة الدقيقة مؤقتا.

قم بتغطية المستضدات التي تمت طباعتها للتو بورق الألمنيوم لمنع التبخر ، واكشف المجموعة التالية من المستضدات المراد طباعتها. ثم تابع برنامج الطباعة. بعد طباعة جميع المستضدات ، قم بتغطية لوحة المصدر بقطعة جديدة من ورق القصدير ، وقم بتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

ضع الشرائح المطبوعة في صندوق شرائح ، وأغلقها بالمكنسة الكهربائية. يمكن استخدام العروض التقديمية في اليوم التالي ، أو حتى شهر واحد بعد ذلك. لاستكشاف المصفوفات الدقيقة باستخدام الأمصال المخففة باستخدام غرف الحضانة ، ضع الشرائح في إطارات.

ثم أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل سطح مصفوفة. ضع الفيلم اللاصق فوق الإطار وانقله إلى وعاء محكم الغلق به قطعة من المناديل المبللة. بعد ذلك ، احتضن الشرائح عند أربع درجات مئوية على الروك طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بتخفيف عينات المصل من واحد إلى 100 في المخزن المؤقت المانع. ثم استنشق محلول الحجب من المصفوفات ، وأضف 500 ميكرولتر من العينة المخففة إلى كل سطح مصفوفة. بعد ذلك ، قم بتغطية المصفوفات بغشاء لاصق ، واحتضانها عند أربع درجات مئوية ، مع التأرجح لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بشفط عينات المصل من المصفوفات ، واستخدم مخزن الشطف لشطف أسطح المصفوفة أربع مرات عن طريق صب المخزن المؤقت على الشرائح وإزالته بسرعة. استخدم 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لغسل كل سطح مصفوفة ، واحتضن 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل سطح شريحة ، واستخدم غشاء لاصق لتغطيته.

احتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية مع التأرجح لمدة 45 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بشفط خليط الأجسام المضادة الثانوية من الشرائح واشطفها أربع مرات ، كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، اغسل الشرائح ب 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف ، ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.

قم بإزالة الشرائح من الإطارات ، ثم ضعها في رف منزلق معدني ، واغمرها في PBS. احتضن في درجة حرارة الغرفة مع الرج المداري لمدة 20 دقيقة. ضع رفا منزلقا في وعاء من الماء منزوع الأيونات لمدة 15 ثانية.

ثم ضع الرف في وعاء جديد من الماء ، واحتضنه لمدة 15 ثانية أخرى. لتجفيف الشرائح، ضع رف الانزلاق على محول لوحة ELISA في جهاز الطرد المركزي، وقم بالدوران عند 220 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في صندوق محكم خفيف حتى تصبح جاهزة للمسح.

لمسح الشرائح ضوئيا ، استخدم ماسحا ضوئيا دقيقا يمكنه اكتشاف إشارات الفلورسنت SI three و SI Five حدد الأنبوب المضاعف الأمثل ، أو إعدادات PMT ، عن طريق المسح المسبق لشريحة مكتبة مستضد كاملة تم فحصها فقط بالأجسام المضادة الثانوية. قم بتعيين قيم PMT المستخدمة بالضغط على زر الجهاز بحيث يكون لميزات IgG البشرية على قناة SI الثلاث ، وميزات IGM البشرية على قناة SI الخمس ، متوسط شدة مضان مماثل مطروحا منه الخلفية ، أو MFIB ، والذي عادة ما يكون 40،000.

بعد ذلك ، امسح الشرائح التجريبية على القناتين بالضغط على زر المسح. احفظ صور الشرائح في كلتا القناتين بعد كل مسح. باستخدام زر الملف ، قم بتحميل الشريحة المراد تحليلها في برنامج المصفوفة الدقيقة.

بعد ذلك ، استخدم زر الملف لتحميل قائمة مصفوفة الجينات ، أو ملف GAL ، الذي يحتوي على تخطيط المصفوفة ، مع هويات ميزات المصفوفة. ضع قالب المصفوفة فوق الصورة الممسوحة ضوئيا، بحيث تتطابق ميزات المصفوفات مع القالب قدر الإمكان. اضغط على زر المحاذاة لمحاذاة الميزات في جميع الكتل مع القالب.

يقوم البرنامج بعد ذلك بحساب MFI ناقص الخلفية لكل مستضد. أخيرا ، استخدم زر الملف لتصدير النتائج كملف نصي ، وتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص. في هذا الشكل ، الذي يظهر شرائح التحكم الإيجابية والسلبية ، يتم فحص الشريحة السلبية فقط بالأجسام المضادة الثانوية ، ويتم فحص شريحة التحكم الإيجابية بمصل من مريض مصاب بالذئبة الحمامية الجهازية.

كما هو موضح هنا ، يظهر أن مصل التحكم الإيجابي ، مع تفاعل معروف مع riboP يحتوي على أجسام مضادة IgM ضد الحمض النووي أحادي الشريطة ، والأجسام المضادة IgG ضد riboP. لوحظت استجابات خطية مع IgM على جميع تخفيفات المصل ، ومع IgG حتى MFI ناقص خلفية تبلغ حوالي 30،000. في هذه التجربة ، يتم فحص المصفوفة بمصل بشري من مريض مصاب بالتهاب الأوعية الدموية الغلوبيولين البردي ، مع عامل روماتويدي موثق ، وهو جسم مضاد IgM ضد IgG.

ميزة IgG هي الأصفر والأخضر بسبب ارتباط IgM في مصل المريض ب IgG الثابت على المصفوفة. باستخدام الأجسام المضادة الثانوية وحدها ، لا يظهر أي تفاعل IgM ضد IgG الذي تم رصده على المصفوفة. كما هو موضح هنا ، تم اكتشاف IgM و IgG الماوس على المصفوفة ، فقط باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر ل IgM و IgG على التوالي.

يوضح هذا الشكل محاذاة شبكة القالب على صورة مصفوفة ممسوحة ضوئيا، باستخدام برنامج تحليل المصفوفات الدقيقة. بمجرد المحاذاة ، يمكن تحليل ميزات المصفوفة للحصول على متوسط شدة التألق مطروحا منه الخلفية لكل ميزة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء فحص المصفوفات الدقيقة للمستضد في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل ELISA من أجل التحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها من المصفوفات الدقيقة للمستضد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية طباعة المصفوفات الدقيقة للمستضد ، وكيفية فحص المصفوفات الدقيقة للمستضد باستخدام المصل ، وكيفية مسح المصفوفات الدقيقة للمستضد باستخدام ماسح ضوئي. لا تنس أن العمل مع المصل البشري يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب اتخاذ الاحتياطات الشاملة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.