توصيف مجمعات متعدد فرعية البروتين من MXA الإنسان عن طريق عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام الكهربائي

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد عدد الوحدات الفرعية في مجمعات البروتين المتماثل في محللات الخلايا باستخدام الرحلان الكهربائي لجل دوديكوسلفات الصوديوم وبولي أكريلاميد غير المتمسخ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، مثل حالة القلة للبروتينات المشاركة في العمليات الخلوية الأساسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب تنقية مجمعات البروتين المتماثلة أو المعدات المتخصصة باهظة الثمن.

لذلك ، يمكن إجراؤه في معظم المختبرات. تستخدم هذه التجربة نوعين من الخلايا. خلايا A549 التي تعبر عن مقاومة الفيروس المخاطي الداخلي بروتين A ، أو MxA ؛ والخلايا الفيروسية التي تفرط في التعبير عن MxA.

قم بزرع خلايا A549 والخلايا الفيروسية في ستة أطباق بئر مع ملليلترين من وسط النمو لكل بئر. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا. في اليوم التالي ، حصاد الخلايا.

اغسل كل بئر بمليلتر واحد من PBS وقم بإرفاق الخلايا بإضافة 0.5 مل من محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.25٪ لمدة خمس دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تنفصل الخلايا عن الطبق ، أضف 0.5 مل من وسط النمو ، واخلطها بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. انقل خلايا كل بئر إلى أنبوب سعة ملليلتر ، وقم بتكبيرها باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينة دون إزعاج حبيبات الخلية. اغسل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS المثلج وسحب تعليق الخلية بعناية لأعلى ولأسفل. بيليه الخلايا في جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينة دون فصل حبيبات الخلية. أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، ثم ضعها على الثلج. قم بحماية المحللة على الفور من الضوء عن طريق تغطية الأنابيب بورق القصدير لأن اليودوأسيتاميد الموجود في عازلة التحلل حساس للضوء.

احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة. يعد استخدام اليودوأسيتاميد أمرا بالغ الأهمية لأن اليودوأسيتاميد يحمي بشكل لا رجعة فيه مجموعة الثيول من السيستين الحر عن طريق تكوين رابطة ثيويثير ويمنع تراكم البروتين الاصطناعي. بعد ذلك ، قم بإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا على سطح الطاولة.

أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد أعمدة غسيل الكلى بقطع الوزن الجزيئي 10،000. قم بتوصيل أعمدة غسيل الكلى بعوامة عائمة وضعها في دورق مملوء بمخزن غسيل الكلى المبرد مسبقا لموازنة الأعمدة. لا تلمس الغشاء.

ضع أداة النمام المغناطيسية في دورق وانقل الدورق إلى الغرفة الباردة. باستخدام أداة النمام المغناطيسية لضمان التحريك اللطيف ، قم بالتوازن لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة الأعمدة من مخزن غسيل الكلى والعوامة العائمة.

انقل المحللات التي تم تطهيرها إلى أعمدة غسيل الكلى المعدة عن طريق سحب العينة دون لمس الغشاء. نعلق الأعمدة على عوامة عائمة. ضعهم مرة أخرى في الدورق المملوء بمحلول غسيل الكلى ، ثم انقل الدورق إلى الغرفة الباردة.

غسيل الكلى للمحللة لمدة أربع ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية مع التقليب بعناية باستخدام محرك مغناطيسي لإزالة المستقلبات الصغيرة والأملاح التي يمكن أن تتداخل مع الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد غير المتمسخ. عند اكتمال غسيل الكلى ، انقل كل عينة محللة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي على الطاولة.

يجب إجراء الرحلان الكهربائي مباشرة بعد غسيل الكلى للمحللات لمنع تفكك مجمعات البروتين قليل القلة. املأ حجرة الجل الداخلية والخارجية بمخزن مؤقت مبرد مسبقا. قم بتشغيل جل بولي أكريلاميد غير المتغيرة مسبقا مع مخزن مؤقت مبرد مسبقا عند 25 مللي أمبير لكل هلام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

امزج 15 ميكرولترا من المحللة المحضرة مع خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت للعينة 4X. قم بتحميل معيار البروتين الأصلي المفضل و 15 ميكرولترا من العينة على الجل. قم بتشغيل الجل على حرارة 25 مللي أمبير لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية.

عند اكتمال الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد غير المتغير، قم بتفكيك الجل ونقله بعناية إلى عازلة SDS. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. قم بإعداد إسفنجتين ، وأربع أوراق ترشيح السليلوز ، وغشاء نشاف لكل هلام وانقعها في محلول النشاف.

قم بتجميع الساندويتش على النحو التالي من الأسفل إلى الأعلى. إسفنجة واحدة ، ورقتان من ورق ترشيح السليلوز ، غشاء نشاف ، هلام ، ورقتان من ورق ترشيح السليلوز ، وإسفنجة واحدة. ضع الساندويتش في خزان النشاف ، وتأكد من أن الغشاء يواجه عمود الجمع ، بينما يواجه الجل قطب الناقص.

املأ خزان النشاف بمحلول نشاف مبرد مسبقا. للحصول على أفضل نتائج نقل البروتين ، امسح 90 مللي أمبير بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتفكيك الساندويتش.

احتضان الغشاء في محلول Ponceau S لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتصور معيار البروتين. قم بإزالة الغشاء عن طريق وضعه في ماء منزوع الأيونات وغسله. بعد نقل الغشاء إلى صينية ، ضع علامة على أشرطة معيار البروتين باستخدام قلم.

سد الغشاء بمحلول مانع لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، يتم تصور البروتينات ذات الأهمية عن طريق التلوين المناعي باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة للأرانب موجه ضد MxA كما هو موضح في بروتوكول النص. تم نقل الخلايا الفيروسية التي تفتقر إلى MxA الداخلي مع النوع البري المؤتلف MxA والتباين الأحادي والثنائي MxA.

أكدت هجرة تباين MxA المؤتلف عند وزنها الجزيئي المتوقع حالتها قليلة القلة. هاجر النوع البري المعبر عنه خارج الرحم MxA كرباعي. ثم تم استخدام هذه البروتينات المؤتلفة لتقييم حالة القلة لبروتين MxA البشري الداخلي المشتق من خلايا A549 المحفزة بالإنترفيرون ألفا.

كشفت النتيجة أن حجم MxA في محللات خلايا A549 المحفزة بالإنترفيرون ألفا يتوافق مع رباعي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يوم ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم تجميد العينات وإذابتها أثناء الإجراء بأكمله ، لأن هذا قد يدمر تفاعلات البروتين أو يتسبب في تراكم البروتين.

بالإضافة إلى ذلك ، عند العمل مع الكواشف الحساسة للضوء ، مثل اليودوأسيتاميد ، من المهم حماية العينات من الضوء أثناء خطوة التحلل. بعد SDS-PAGE غير المتناسق ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل استخراج هلام البروتين والنشاط الأنزيمي AsiS أو PAGE البعد الثاني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل النشاط الأنزيمي وتوصيف المجمعات قليلة القلة المحتملة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف تكوين مجمعات البروتين قليل القلة في الخلايا المستزرعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير محللات الخلايا من مزارع الخلايا لدراسة بروتينات قلة القلة في تحليل PAGE غير المتغير. لا تنس أن العمل مع اليودوأسيتاميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وحماية العين.