معلومات الهيكلية من جزيء واحدة الحنق التجارب باستخدام سريع نانو لتحديد المواقع نظام

العام لنظام تحديد المواقع النانوي السريع هو توفير معلومات هيكلية في الوقت الفعلي للجزيئات الحيوية من خلال الجمع بين تجارب FRET أحادية الجزيء والتحليل الإحصائي الدقيق. تجيب هذه الطريقة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الهيكلية مثل توطين المجالات المرنة في الجزيئات الكبيرة حيث لا يمكن تطبيق أدوات بيولوجيا البنية القياسية. يتمثل التحسن الرئيسي في NPS السريع مقارنة بالأدوات الهيكلية الأخرى القائمة على FRET في أنه يمكن مقارنة نماذج الصبغة المختلفة ليس فقط باستخدام المواضع الأكثر احتمالا ، ولكن توزيع احتمالي ثلاثي الأبعاد.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين البيانات الهيكلية من قاعدة بيانات البروتين وقياسات التألق الكمية أحادية الجزيء. لبدء الإجراء ، قم بتجميع غرفة التدفق وحامل العينة. لتحضير مسامير المدخل والمخرج ، قم بربط أنابيب السيليكون في مسامير تبويب مجوفة وقم بقص الأنبوب بشكل مستقيم على كلا الطرفين بشفرة حلاقة.

قم بربط مسامير علامة التبويب بحامل العينة. قم بمحاذاة فتحات شرائح الكوارتز في غرفة التدفق مع خيوط حامل العينة. اربط مسامير الحامل الزجاجي برفق لتثبيت غرفة التدفق في مكانها.

قم بربط قطع طويلة من أنابيب السيليكون بطول 20 سم في مسامير المدخل والمخرج. اغسل غرفة التدفق ب 500 ميكرولتر من PBS. ثم اغسل غرفة التدفق ب 100 ميكرولتر من محلول النيوترافيدين في PBS ، مع التأكد من تشكل قطرة في نهاية أنبوب المدخل لمنع الهواء من دخول غرفة العينة.

قم بتثبيت أنبوب المدخل والمخرج بعد كل معالجة لاستبعاد الهواء من غرفة التدفق. احتضن الغرفة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل محلول النيوترافيدين ب 500 ميكرولتر من PBS.

أضف قطرة من زيت الغمر على المنشور ، وقم بربط المنشور في غرفة العينة. يتم الحصول على بيانات FRET أحادية الجزيء باستخدام مجهر مضان انعكاس داخلي كلي. ابدأ تشغيل برنامج الكاميرا وبرنامج محرك ضغطية للمرحلة.

قم بتركيب الغرفة على مرحلة الميكرومتر من مجهر TIRF أفقيا ، بشكل مستقيم قدر الإمكان ، وبطريقة تتقاطع مع جميع أنواع الليزر الثلاثة. أضف سائل الغمر ، وركز هدف المجهر عن طريق التحقق من انعكاسات الأشعة تحت الحمراء. قم بتعيين معلمات الكاميرا ومسار الملف ومعلمات الزيادة التلقائية.

ابدأ تغذية الكاميرا الحية وتألق خلفية التبييض باستخدام جميع أنواع الليزر الثلاثة بكثافة كاملة. ثم قم بخفض شدة الليزر. ثم قم بتحميل 100 ميكرولتر من محلول حبة الفلورسنت في الغرفة.

انتظر 10 دقائق حتى تلتصق الخرزات بسطح الغرفة. سجل فيلما بمجال رؤية من 50 إلى 100 خرزة ، وقم بإجراء تحليل دفعي مع عتبة عالية لإيجاد الذروة. قم بتحميل ملف الفيلم، واختر خرزتين بمركزين متميزين في زوايا متقابلة من مجال الرؤية.

حدد وحدات البكسل ذات الكثافة القصوى في تلك الخرز. قم بإزالة وتنظيف المنشور. قم بإعداد غرفة عينة ثانية ، وقم بربط حامل المنشور في الغرفة.

قم بتركيب الغرفة على مرحلة الميكرومتر. بعد ذلك ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من محلول بيكوملار من 50 إلى 100 من العينة المصنفة بالفلورسنت البيوتينيل في الغرفة. انتظر حتى تلتصق الجزيئات بسطح الغرفة.

انقر في نفس الوقت فوق Take Signal لبدء التسجيل وتشغيل ليزر إثارة المانح. اضبط طاقة الليزر للتأكد من أن ما لا يقل عن 80٪ من الجزيئات في مجال الرؤية مبيضة ، ثم حرك الغرفة لإظهار منطقة غير مبيضة ، وسجل الفيلم التالي. قم بتبييض باقي غرفة العينة بهذه الطريقة.

بعد القياسات في مجهر TIRF ، يجب تحليل بيانات FRET أحادية الجزيء المكتسبة للحصول على متوسط كفاءة FRET. قم بإجراء تحليل دفعي لأفلام المتبرع والمستقبل للعينة. بعد ذلك ، قم بتحميل ملفات الأفلام المجمعة في برنامج تحليل البيانات.

انقر فوق الزر غير محدد للإشارة إلى مراحل FRET الفردية. انقر فوق بداية فترة FRET ، ثم النقطة الزمنية التي تقل فيها شدة المستقبل بسبب التبييض ، وأخيرا النقطة الزمنية التي تقل فيها شدة المتبرع بسبب التبييض. في النافذة التالية، حدد نعم للاحتفاظ بتتبع كفاءة FRET المحدد.

بمجرد تحليل كل جزيء ، احفظ الآثار وحلل الفيلم التالي. بمجرد اكتمال التحليل ، قم بتشغيل برنامج نصي لدمج نتائج FRET. قم باستيراد ملف FRET المدمج بالإطار إلى برنامج تحليل البيانات باستخدام خيار الإدخال الافتراضي.

ارسم البيانات كرسم بياني ، واستخدم أداة تركيب المنحنى غير الخطي لتناسب Gaussian. قيمة التجاوز هي كفاءة FRET الرئيسية. استخدم الأشعة فوق البنفسجية VIS والتحليل الطيفي الفلوري لتحديد نصف قطر فورستر المتناحي ، وقيم تباين الحالة المستقرة لكل صبغة.

تم استلهام نظام تحديد المواقع النانوي من نظام تحديد المواقع العالمي (GPS) المعروف ، حيث نقوم بتحديد موقع غير معروف ، الهوائي ، مع العديد من المواقع المعروفة ، الأقمار الصناعية. لبدء تحليل NPS، قم بتشغيل برنامج FastNPS وإنشاء ملف وظيفة جديد. لتحديد الموضع السابق للهوائيات والأقمار الصناعية المسماة، في النافذة ModelDyePrior، أدخل الاستبانة المكانية للموضع الذي يتم تحديده.

استبعاد الجزء الداخلي من الجزيء الكبير عن طريق تحميل ملف PDB المركزي المقابل. أدخل قطر الصبغة ومسافة الهيكل العظمي. املأ إحداثيات الموضع الأدنى والقصوى لموقع الصبغة المحتمل.

إذا كان الموضع الذي يتم تحديده هو قمر صناعي، فحدد مرفق الصبغة عبر رابط مرن، وأدخل إحداثيات الذرة من ملف PDB المركزي. املأ طول وقطر الرابط. انقر فوق حساب الحجم الذي يمكن الوصول إليه، واحفظ الموضع مسبقا، وقم بتصديره للمرئيات.

كرر هذه العملية لجميع الأقمار الصناعية والهوائيات. بمجرد تحديد المواضع ، افتح نافذة تحديد القياس ، وقم بإنشاء جزيء صبغة جديد. قم بتحميل الموضع السابق المرتبط بتلك الصبغة.

املأ تباين الخواص الفلورية ، وحدد نموذج صبغة مناسبا ، وقم بتنشيط الصبغة. كرر هذه العملية حتى يتم تحديد جميع الأصباغ. ثم قم بإنشاء قياس جديد.

حدد زوج FRET من الأصباغ المحددة. أدخل كفاءة FRET أحادية الجزيء مع الخطأ ، ونصف قطر فورستر المتناحي لهذا الزوج من الصبغة ، وقم بتنشيط القياس. كرر هذا لجميع أزواج الأصباغ.

بعد ذلك ، افتح نافذة الحساب. إذا تم تعيين الأصباغ لطرز مختلفة، فحدد محدد من قبل المستخدم. خلاف ذلك ، حدد النموذج لاستخدامه لجميع الأصباغ.

قم بإجراء العملية الحسابية وافتح نافذة النتائج. عند استخدام FastNPS ، من المهم أن تتذكر تكييف النماذج لجميع الأصباغ من أجل تقليل الأحجام الموثوقة ، مع الحفاظ على الاتساق بالطبع. إذا كان الاتساق أقل من 90٪ ، فانقر فوق التناسق التفصيلي ، وحدد الأصباغ الشائعة في الإدخالات ذات الاتساق أقل من 90٪.

افتح نافذة تحديد القياس ، وقم بتغيير طراز الصبغة المعنية. أعد تشغيل الحساب في الوضع معرف المستخدم. تصدير الأحجام الموثوقة من الأصباغ منفردة أو دفعة.

افتح ملفات الكثافة في برنامج التصور ، واضبط المصداقية على المستوى المطلوب. تم قياس كفاءات FRET أحادية الجزيء بين جزيئات الهوائي غير المعروفة والعديد من جزيئات الأقمار الصناعية المعروفة داخل مركب محفز مفتوح للبوليميراز الحمض النووي الريبي البدائي. حدد تحليل NPS لهذه البيانات الأحجام الموثوقة لجزيئات الصبغة هذه بالنسبة لمركب الحمض النووي الريبي البوليميراز المفتوح البدائي.

خمسة نماذج مختلفة حيث تم استخدام جزيئات الصبغة ، وتمت مقارنة النتائج. كانت الأحجام الموثوقة متسقة مع البيانات المقاسة عند حسابها باستخدام النماذج التي افترضت أن الصبغة لا يمكن أن تدور بحرية إلا داخل مخروط غير معروف الاتجاه. النموذج الكلاسيكي على وجه الخصوص هو الأكثر تحفظا ، لأنه يفترض أيضا أن الصبغة في مكان ثابت.

يؤدي هذا إلى إنشاء حجم كبير نسبيا وموثوق به ، لكن الحجم يرفق الموضع الصحيح بشكل عام. تستخدم النماذج عالية الدقة افتراض أن الصبغة حرة تماما في الدوران خلال عمرها المضان. يفترض نموذج iso ، مثل النموذج الكلاسيكي ، أن الصبغة في موضع ثابت داخل الحجم الذي يمكن الوصول إليه.

يفترض نموذج meanpos-iso المتوسط الديناميكي على جميع المواضع الممكنة. في حين أن الأحجام الموثوقة لنماذج ISO أصغر بكثير من تلك المحسوبة بواسطة النماذج غير ISO ، إلا أنها لا تتوافق مع البيانات المقاسة. أردنا تطوير تقنية تسمح لنا بالتقاط المعلومات الهيكلية الديناميكية للمجمعات العابرة ، وهي مشكلة لا يمكن معالجتها بواسطة الأدوات الهيكلية الحالية.

بمجرد تسجيل بيانات FRET أحادية الجزيء ، يتم إجراء تحليل FastNPS في غضون ساعتين ، مما يسمح بإجراء مقارنة سريعة لنماذج الصبغة المختلفة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل محاكاة MD لاحقا من أجل الحصول على نماذج منظمة تتوافق مع بيانات FRET أحادية الجزيء التجريبية.