المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة المطثية العسيرة سلالة R20291

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير دليل خطوة بخطوة لتنفيذ نموذج فأر سيفوبيرازون لعدوى المطثية العسيرة ، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الأمراض السريرية ، وتعداد البكتيريا ، والسمية الخلوية السمية ، والتغيرات النسيجية المرضية بعد التحدي. سيساعد هذا البروتوكول التفصيلي الباحثين على تنفيذ نموذج فأر لعدوى المطثية العسيرة بدقة ، وهو أمر ضروري لدراسة التسبب في هذه البكتيريا والوصول إلى علاجات جديدة. الميزة الرئيسية لاستخدام نموذج الفأر هذا هي أن التعرض لمضاد حيوي واحد لمدة خمسة أيام يجعل الفئران عرضة لاستعمار المطثية العسيرة ودورة سريرية طويلة من العدوى بالتزامن مع الأمراض البشرية.

للبدء ، خذ سلالة مخزون C.difficile ذات الأهمية والدوامة. في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بتخفيف المخزون في الماء المعقم في أنبوب غطاء لولبي بتركيز عشرة إلى الجراثيم الخامسة لكل 25 ميكرولترا. قم بتسمية الخليط على أنه لقاح بوغ وضع الأنبوب في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بوضع ماصة 50 ميكرولترا من لقاح الأبواغ الساخنة في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وقم بتمريره إلى الغرفة اللاهوائية حتى الاستخدام الآخر. قم بتحميل لقاح البوغ المتبقي في حقنة سعة ملليلتر واحد متصلة بإبرة تزقيم معدية مائلة لمبة. في غطاء التدفق الصفحي ، خذ فأرا موضوعيا وقم بتثبيت الرأس عن طريق تقييد برفق من الجلد الفضفاض للرقبة والظهر.

باستخدام السبابة ، والتأكد من أن لا ينطق أو يظهر علامات الضيق ، يزيد من شل حركة رأس وإطالة المريء. حافظ على الماوس في وضع رأسي وعمودي وقم بتمرير إبرة التزقيم برفق إلى جانب الفم. قم بتوجيه إبرة التزقيم على طول سقف الفم وتقدمها ببطء إلى المريء.

بمجرد أن تصل الإبرة إلى منتصف المريء تقريبا ، قم بحقن 25 ميكرولترا من لقاح الأبواغ ثم اسحب الإبرة برفق. أعد إلى قفصه ، وراقبه بحثا عن أي علامات للسعال أو ضيق التنفس قد يشير إلى إعطاء القصبة الهوائية عن غير قصد. بعد ذلك ، خذ لقاح البوغ المخزن مسبقا في الغرفة اللاهوائية ، وأي لقاح بوغ متبقي للتزقيم ، وقم بعمل واحد إلى عشرة تخفيفات تسلسلية في 180 ميكرولتر من 1x PBS.

قم بإجراء أربعة إلى خمسة من هذه التخفيفات. باستخدام تقنية التعقيم ، انقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي إلى لوحة TCCFA فردية. أخذ مفرشة معقمة جديدة على شكل حرف L في كل مرة ، وزع لقاح التخفيف بالتساوي على كل طبق.

احتضان الصفائح في ظروف لاهوائية لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. أخيرا ، قم بحساب مستعمرات المطثية العسيرة على كل لوحة تخفيف واحسب وحدات تشكيل المستعمرة للحصول على الجرعة المعدية التي يتم إعطاؤها للفئران. لجمع عينات البراز من الفئران للتقييم ، قم أولا بتقييد الفأر الموضوع برفق ولكن بقوة من الجلد المترهل على الرقبة والظهر ، مما يضمن عدم تعرض للمحنة.

باستخدام الإصبع الخنصر ، ارفع ذيل برفق ، وفضح فتحة الشرج. امسك أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بوزن معروف مباشرة تحت فتحة الشرج للحيوان ، مما يضمن عدم لمس الأنبوب للماوس مباشرة. عندما يتغوط ، اجمع الحبيبات البرازية في الأنبوب.

قم بتخزين الأنبوب في درجة حرارة الغرفة حتى يتم جمع جميع العينات اللازمة. قم بوزن الأنابيب التي تحتوي على البراز على مقياس تحليلي وسجل الكتلة إلى أربعة منازل عشرية. احسب وزن الحبيبات البرازية بطرح وزن الأنبوب.

بعد ذلك ، احسب تخفيفا من واحد إلى عشرة من المحتويات وأعد تعليقه إلى 1x PBS. استخدم طرف الماصة لتعطيل البراز برفق في المحلول. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مما يسمح للمحتويات بالاستقرار.

الحفاظ على المحاليل بشكل لاهوائي ، قم بعمل تخفيفات تسلسلية لكل عينة في 1x PBS. انقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي على ألواح TCCFA. استخدم موزعة معقمة على شكل حرف L وقم بتطبيق الوسائط بالتساوي على الألواح.

احتضان الصفائح في ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. أخيرا ، تعداد مستعمرات المطثية العسيرة واحسب وحدة تكوين المستعمرة لكل جرام من محتوى البراز. يوضح هذا الشكل وزن الفأر في الأيام التي أعقبت التحدي مع C.difficile R20291.

في اليوم صفر ، يتم ضبط الوزن الأساسي على 100. تم قياس متوسط وزن جسم الفأر كل يوم بعد ذلك ، لمدة 14 يوما. لوحظ انخفاض كبير في الوزن في الفئران التي واجهت تحديا في الأيام الثانية إلى السابعة بعد التحدي.

بدا أن الفئران تتعافى وتستعيد وزنها بعد هذه النقطة. هنا ، يتم عرض حمل C.difficile في البراز في أيام ما بعد التحدي. في 24 ساعة بعد التحدي ، تم استعمار جميع الفئران ب 10 إلى 7 CFUs لكل جرام من البراز.

انخفض هذا الحمل بحلول اليوم السابع فصاعدا ، على الرغم من أن المطثية العسيرة لا تزال موجودة. أظهر الفحص النسيجي المرضي للفئران على مدار العدوى التغيرات المرضية الأكثر أهمية في الأعور. كان إجمالي درجات الأنسجة الرأسية مختلفة بشكل ملحوظ بين اليوم صفر واليومين الثاني والرابع بعد التحدي.

بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في نموذج الفأر هذا من حساب وإعداد لقاح البوغ المستخدم لتحدي الفئران وحساب الحمل البكتيري للبراز المطثية العسيرة. أثناء محاولة هذا البروتوكول ، من المهم أن تتذكر أن التعديلات على جرعة أو سلالة جراثيم المطثية العسيرة التي تعطى للفئران قد تغير نتيجة هذا النموذج.