بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

الهدف العام من هذا الاختبار هو الكشف عن تفاعلات البروتين والحمض النووي باستخدام مجسات غير مشعة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية ، مثل تحديد تسلسل البروتينات المستهدف للحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بديل سهل وآمن وموفر للوقت لاستخدام المجسات المشعة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد هلام بولي أكريلاميد أصلي بنسبة خمسة بالمائة يحتوي على 0.5x tris borate EDTA أو TBE ، و 2.5٪ جلسرين باستخدام نظام هلام البروتين الصغير. لتحضير 30 مل من محلول الجل لأربعة مواد هلامية ، اخلطي الماء المقطر ، TBE ، بيرسلفات الأمونيوم ، TEMED ، الأكريلاميد مكرر ، والجلسرين. مرر محلول الجل على الفور.

بعد البلمرة ، لف المواد الهلامية في غلاف بلاستيكي شفاف مبلل مسبقا ب 0.5x TBE وقم بتخزينها على أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، صمم قليل النوكليوتيد طويل لحوالي 51 مرسا. تصميم قليل النوكليوتيدات القصيرة التكميلية لما يقرب من 14 مرس مع تعديل صبغة الفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء في النهاية الأولية الخمسة.

بمجرد تحضير قليل النوكليوتيدات ، أعد تعليقها في 1x Tris-EDTA إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكرومولار. للتلدين ، امزج 0.6 ميكرولتر من خمسة قليل النوكليوتيدات القصيرة ذات الصبغة الأولية ، و 1.2 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد الطويل ، و 28.2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم Tris-EDTA في أنبوب 1.5 مل. ضع الأنبوب في الماء المغلي لمدة خمس دقائق ، ثم أغلق مصدر الحرارة واترك الماء مع قليل النوكليوتيدات الملدنة يبرد طوال الليل في الظلام.

لعمل مجسات الحمض النووي مزدوجة الشريطة ، امزج 30 ميكرولترا من قليل النوكليوتيدات الملدنة مع DNTPs ، و Klenow buffer ، و Klenow five prime صبغة ، والماء المقطر المزدوج في أنبوب PCR سعة 0.2 مل. احتضن الخليط لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جهاز PCR. ثم أضف 3.4 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA لإيقاف التفاعل ، وقم بتعطيل الحرارة عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز PCR.

بعد ذلك ، قم بتخفيف المجسات المملوءة بكلوريد الصوديوم Tris-EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 ميكرومولار. قم بتخزين قليل النوكليوتيدات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر في الظلام حتى تصبح جاهزة للاستخدام. لتحضير مجسات غير مصنفة ، امزج 20 ميكرولترا من قليل النوكليوتيد الطويل ، و 20 ميكرولترا من قليل النوكليوتيد Long R ، و 60 ميكرولترا من محلول كلوريد الصوديوم Tris-EDTA في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

ضع الأنبوب في الماء المغلي لمدة خمس دقائق ، ثم أوقف تشغيل مصدر الحرارة واترك الماء مع أوليغوس الملدن يبرد طوال الليل. قم بإعداد مليلتر واحد من 5x المخزن المؤقت الملزم عن طريق خلط Tris HCl ، كلوريد الصوديوم ، كلوريد البوتاسيوم ، كلوريد المغنيسيوم ، EDTA ، DTT ، BSA ، والماء المقطر المزدوج. قبل إعداد تفاعلات الربط ، قم بتشغيل جل بولي أكريلاميد الأصلي بنسبة 5٪ مسبقا في 0.5x TBE و 2.5٪ جلسرين لإزالة جميع آثار بيرسلفات الأمونيوم عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة ، أو حتى لا يتغير التيار بمرور الوقت.

بعد ذلك ، امزج أربعة ميكرولترات من 5x ملزمة مؤقتة ، و 80 إلى 200 نانوجرام من البروتين المنقى A ، وميكرولتر واحد من مسبار مترافق بصبغة 0.1 ميكرومولار ، وماء مقطر مزدوج. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتحميل كل تفاعل الربط على الجل وقم بتشغيل الجل بسرعة 10 فولت لكل سنتيمتر إلى المسافة المطلوبة.

قم بتغطية جهاز الجل بالألمنيوم للحفاظ على الجل في الظلام قدر الإمكان. نظف سرير الماسح الضوئي من نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء بالماء المقطر. امسح الألواح الزجاجية التي تحتوي على الجل وضعها على سرير الماسحة الضوئية.

افتح برنامج التصوير بالأشعة تحت الحمراء وانقر فوق علامة التبويب اكتساب. بالنسبة للألواح السميكة ، استخدم إعدادات 700 للقناة ، وتلقائي للكثافة ، و 84 ميكرومتر للدقة ، ومتوسط للجودة ، و 3.5 ملم لإزاحة التركيز البؤري. حدد المنطقة التي يشغلها الجل على الماسحة الضوئية.

أخيرا ، انقر فوق ابدأ لبدء الفحص. يمكن تصور تقدم الرحلان الكهربائي باستخدام صبغة تحميل Orange G ، بينما يتم اكتشاف Bromophenol blue أثناء المسح وبالتالي يتداخل مع تحليل الصورة. أدت إضافة dI-dC إلى تفاعل الربط إلى إلغاء ربط 6xHis-SOX-2 المنقى بمجسات الحمض النووي للصبغة الرئيسية الخمسة.

إن المسبار البارد LIM-4 المتحور و SOX-2 المتحور في موقع ربط LIM-4 فعال مثل المسبار البارد من النوع البري في التنافس مع مسبار صبغة الفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء المسمى للارتباط ب 6xHis-SOX-2. ومع ذلك ، فإن كفاءة المنافسة لمسبار البارد المتحور LIM-4 و SOX-2 المتحور في موقع ربط SOX-2 أقل بكثير من المسبار البارد من النوع البري للارتباط ب 6xHis-SOX-2. أدت فحوصات Supershift لمركب الحمض النووي SOX-2 باستخدام 6xHis وحواتم العلم إلى نطاق DNA SOX-2 فائق النقل.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء مجسات الأشعة تحت الحمراء في الظلام. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحرير جينوم CRISPR cas9 من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل أهمية تسلسل ربط DNA معين.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الكيمياء الحيوية لاستكشاف تفاعلات البروتين والحمض النووي في الكائنات الحية النموذجية المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تفاعلات البروتين والحمض النووي باستخدام ملصقات الحمض النووي غير المشعة. لا تنس أن العمل مع مادة الأكريلاميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.