الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد كمية الفسفرة الذاتية لكينازات الهيستيدين البكتيرية المنقاة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الإشارات المكونة. مثل تأثير المحفزات المماثلة في تفاعلات البروتين والبروتين على الفسفرة الذاتية لكينازات الهيستيدين.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها طريقة إنتاجية عالية يمكن استخدامها للكشف بدقة عن بيكومولات الفوسفوهيستادين المتكونة والحصول على المعلمات الحركية لكينازات الهيستيدين. بصفتي زميلا لما بعد الدكتوراه ، أستخدم الترشيح على أغشية النيتروسليلوز لتحديد الروابط المشعة المرتبطة بالبروتين. وبالتالي ، كان من المنطقي تطوير تقنية مماثلة لقياس فسفرة الهيستيدين في كينازات الهيستيدين البكتيرية.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد الكواشف والمواد كما هو موضح في بروتوكول النص. لإنشاء جهاز 96 نقطة بئر ، قم بقطع قطعة من غشاء النيتروسليلوز بحجم ثمانية سنتيمترات × 12 سم. ضع النيتروسليلوز في جهاز المخطط النقطي.

تأكد من أن الغشاء مناسب بحيث يكون الجهاز مغلقا وأن جميع الآبار مغطاة بالكامل بالغشاء. لجمع المرشح ، قم بتوصيل الجهاز بقارورة السلاح الجانبي الثانوية. من جذع الصمام ، قم بتوصيل الأنبوب المناسب للسماح باستخدام الجهاز بشكل مريح دون قلب القارورة الثانوية.

بعد ذلك ، قم بتوصيل قارورة السلاح الجانبي الثانوية بمصدر فراغ شفاطة. اختبر أن الجهاز مغلق تماما عن طريق تطبيق فراغ على الجهاز. إذا تم تجميع الجهاز بشكل صحيح ، فسيكون هناك فراغ قوي في جميع الآبار.

يمكن لف جميع وصلات الأنابيب في غلاف Parafilm أو Saran لضمان إحكام الإحكام. قبل البدء ، قم بإعداد جميع مكونات التفاعل الأربعة كأربعة حلول مخزون X ، كما هو موضح في بروتوكول النص. امزج كميات متساوية من المخزن المؤقت للتفاعل ، وكيناز الهيستيدين ، والماء المقطر المزدوج.

اسمح لمكونات التفاعل هذه بالتوازن في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة. لبدء التفاعل ، أضف حجما واحدا من محلول جاما -32 P ATP واخلطه عن طريق التمرير لأعلى ولأسفل. تتبع وقت رد الفعل المنقضي باستخدام مؤقت واسمح للتفاعل بالمضي قدما في الوقت المطلوب.

اروي رد الفعل. أضف حصة من التفاعل إلى 325 مللي مولار من حمض الفوسفوريك. ضع التفاعلات المروية على الفور على الجليد حتى يتم إنهاء جميع التفاعلات.

ضع جهاز مخطط البئر 96 المجمع مسبقا في حاوية ثانوية. يجب أن تكون هذه الحاوية كبيرة بما يكفي لتفكيك الجهاز بسهولة ، حيث سيكون الجهاز والغشاء مشعا بعد الاستخدام. ضع فراغا على جهاز 96 نقطة البئر.

بمجرد أن يصبح الجهاز تحت الفراغ ، قم بسحب التفاعل المروي بعناية مباشرة على غشاء النيتروسليلوز في كل بئر. كرر هذه العملية حتى يتم تحميل جميع التفاعلات على الغشاء. نظرا لأن قدرة الارتباط للنيتروسليلوز أكبر من كمية الهيستيدين كيناز المرقط ، فيمكن افتراض أن كل كيناز تقريبا يرتبط بالغشاء عند تحميله بشكل صحيح.

اعتمادا على الجهاز المستخدم ، احرص على عدم ثقب النيتروسليلوز. لاحظ أن كل التفاعل قد اتصلت بالنيتروسليلوز. من السهل على بعض ردود الفعل أن تلتصق بجدران البئر.

اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من حمض الفوسفوريك المثلج البارد 25 ملليمولار. سيسمح ذلك لأي حجم تفاعل قد يكون محاصرا في البئر بالوصول إلى الغشاء ، مما يضمن التحميل الكامل لجميع التفاعلات. اسمح للحجم بأكمله بالتدفق عبر الغشاء.

بتفكيك الجهاز بعناية قبل إغلاق المكنسة الكهربائية. يرجى العلم أن كلا من الجهاز وغشاء النيتروسليلوز مشعا في هذا الوقت. لا تقم بإزالة أي مكونات للجهاز من الحاوية الثانوية.

باستخدام الملقط ، انقل غشاء النيتروسليلوز بعناية من الجهاز إلى وعاء سعة 200 مل تقريبا من حمض الفوسفوريك المثلج 25 ملليمول. ضع غطاءا على هذه الحاوية ، حيث سيكون الغسيل مشعا. في هذا الوقت ، قد يتم إيقاف تشغيل الفراغ.

ضع الحاوية مع غشاء الغسيل على الروك. اترك الغشاء يتأرجح برفق لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، قم بصب محلول الغسيل المستخدم بعناية في دلو كبير لاستخدامه لتخزين النفايات المؤقت.

أضف 200 مل من حمض الفوسفوريك المثلج البارد 25 مللي مولار إلى الغشاء. اغسل الغشاء بهذه الطريقة ثلاث مرات على الأقل لإزالة إشارة GAMA-32 P ATP في الخلفية من الغشاء. بعد الغسيل الثالث ، اختبر محلول الغسيل المستخدم بحثا عن الإشعاع باستخدام عداد جيجر.

استمر في غسل الغشاء حتى لا توجد إشارة في محلول الغسيل. بعد غسل الغشاء بشكل كاف ، اترك الغشاء يجف في الهواء لفترة وجيزة ، والذي يستغرق عادة خمس دقائق أو أقل. بعد تعرض النيتروسليلوز للون أخضر من الفوسفور ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، استعد لتلوين Ponceau S وإزالته.

اغمر غشاء النيتروسليلوز لفترة وجيزة في محلول تلطيخ Ponceau S لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بلل الغشاء بالكامل بالبقعة قبل إزالتها. ثم ، صب Ponceau S الزائد من الغشاء.

اشطف الغشاء بالماء المقطر المزدوج حتى تتلطخ البقع من الهيستيدين كيناز فقط. لاحظ أن هذا الإجراء لن يعمل إلا إذا كانت جميع البقع تحتوي على كميات يمكن اكتشافها من البروتين. باستخدام المقص ، اقطع كل بقعة على غشاء النيتروسليلوز.

ليس من الضروري القطع بشكل مثالي على طول حافة البقعة الملطخة. إذا تم غسل الغشاء بشكل كاف ، فإن الخلفية بسبب اختلاف حجم بقع القطع لا تذكر. من المهم فقط قطع البقعة بأكملها لكل تفاعل.

باستخدام الملقط ، انقل كل بقعة بعناية إلى قوارير متلألئة. لا يلزم وجود كوكتيل تلألؤ ، حيث يمكن اكتشاف الفوسفور 32 بسهولة عن طريق إشعاع Cherenkov. بعد ذلك ، اكتشف عدة تخفيفات لمحلول جاما -32 P ATP على سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد مربعات من النيتروسليلوز.

باستخدام الملقط ، انقل كل مربع بعناية إلى قوارير متلألئة بدون كوكتيل متلألئ. سيتم استخدام هذه العينات لإنشاء منحنى قياسي لتحديد العدد في الدقيقة لكل بيكومول لمحلول ATP. يظهر هنا تلطيخ بونسو لغشاء النيتروسليلوز.

التلوين موحد في جميع العينات ، مما يشير إلى أن جميع العينات محملة بالتساوي. تظهر نتائج التصوير الفلوري لغشاء النيتروسليلوز المستوى النسبي للفوسفوهيستيدين المليء بالإشعاع في كل بقعة. الصف الرابع والثامن عبارة عن عناصر تحكم سلبية تثبت أن ATP الزائد يتم غسله من غشاء النيتروسليلوز.

تظهر هنا النتائج التمثيلية للقياس الكمي للفسفرة الذاتية للهيستيدين كيناز. يتم إنشاء هذه البيانات من عد التلألؤ لكل بقعة مقطوعة من الغشاء. يتم إنشاء المنحنى القياسي للعد في الدقيقة لكل بيكومول من ATP الموضح هنا أيضا من عد التلألؤ ويستخدم لحساب بيكومول الفوسفوهيستيدين الموجود في كل عينة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إضافة طرق أخرى ، مثل إدخال محفزات أو بروتينات متشابهة يفترض أنها تعدل نشاط كيناز ، إلى التجربة للإجابة على أسئلة إضافية مثل تأثير هذه المواد المضافة على نشاط كيناز. لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التدريب المناسب على السلامة من الإشعاع واستخدام معدات الحماية الشخصية والتدريع أثناء تنفيذ هذا الإجراء.