3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

الهدف العام من طريقة تجميع الخلايا المغناطيسية والنضج الديناميكي هو تحسين التكوين الغضروفي في المختبر للخلايا اللحمية الوسيطة أو MSC. يعد التجميع المغناطيسي للخلايا الجذعية بدلا من تكوين الغضروف كتكاثف للخلايا خطوة رئيسية مبكرة في عملية تجديد الغضروف. بعد حصر الخلايا الجذعية في السقالات ، يمكن نقل السقالات إلى المفاعل الحيوي الخلوي لتقييم النضج الديناميكي للخلايا.

يمكن تطبيق طريقة ديناميكية مهمة على الأنظمة الحيوية الأخرى مثل إصلاح العضلات أو القلب أو الأوعية الدموية. ولكن كما سترى ، فهو مناسب تماما لتجديد الغضروف. يعد العرض المرئي لتلقيح الخلايا المغناطيسية ونضج الخلية الديناميكية باستخدام المفاعل الحيوي الفعلي أمرا بالغ الأهمية لأنه يصعب تعلم هاتين التقنيتين من التعليمات النصية فقط.

لبناء جهاز المغناطيس الدقيق لتكوين الكلي ، أدخل أولا طرفا مغناطيسيا بقطر 750 ميكرومتر في كل ثقب يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات في صفيحة ألومنيوم بسمك ستة ملليمترات ، ثم ضع اللوحة فوق مغناطيس نيوديميوم دائم. لبناء جهاز لبذر السقالات ، قم أولا بتقطيع البوليسترين الصلب إلى مربعات 2.4 سم مربع وإدخال مغناطيسات قطرها ثلاثة ملليمترات وستة ملليمترات على مسافة متساوية على سطح 1.6 سم مربع. ثم ضع الجهاز فوق مغناطيس نيوديميوم دائم.

لتسمية الخلايا الجذعية البشرية ، قم أولا بزراعة الخلايا الجذعية في وسط نمو كامل للخلايا الجذعية عند 37 درجة مئوية عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى 90٪. قم بشفط الخلايا ثم شطفها باستخدام مصل ثلاثة RPMI متوسط بدون جلوتامين ، وأضف 10 مل من محلول جزيئات أكسيد الحديد النانوية لكل قارورة مزرعة 150 سنتيمترا مربعا لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا. في نهاية الحضانة ، اشطف الخلايا لمدة خمس دقائق باستخدام مصل ثلاثة RPMI متوسط بدون جلوتامين لاستيعاب جزيئات النانو التي لا تزال متصلة بغشاء البلازما.

ثم استبدل RPMI في كل قارورة ب 25 مل من وسط نمو MSC الكامل وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، افصل الخلايا المغناطيسية بثمانية ملليلتر من 05٪ Trypsin-EDTA لكل قارورة. وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي.

نقوم بتعليق الكريات للعد ونضع طبق بتري لثقافة الخلايا ذات القاع الزجاجي 35 ملم فوق كل جهاز مغناطيسي. لتشكيل الركام مغناطيسيا ، أضف ثلاثة ملليلتر من الوسط الغضروفي إلى كل طبق بتري وقم بإيداع ما لا يزيد عن ثمانية ميكرولترات من 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مجموعة. من الأهمية بمكان ألا تترسب الخلايا ببطء شديد ولا بسرعة كبيرة.

وليس قريبا جدا ولا بعيدا جدا عن المغناطيسية. عندما يتم وضع جميع الركام ، اسمح للكرات بالتشكل لمدة 20-30 دقيقة دون إزعاج. ثم انقل الركام إلى حاضنة زراعة الخلايا.

في نفس اليوم ، قم بتشكيل المجاميع عن طريق الطرد المركزي 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الجذعية الخامسة في أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر مع 1.5 مل من الوسط الغضروني. لزرع السقالات مغناطيسيا ، ضع سقالة مسامية واحدة مجففة من بولولان / ديكستران عديد السكاريد لكل طبق بتري وقم بتخفيف 2 مرات 10 إلى الخلايا المصنفة 6 في 350 ميكرولتر من الوسط الغضروفي بدون TGFbeta3. قم بتقطيع الخلايا بعناية على السقالات واحتضان الهياكل عند 37 درجة مئوية للسماح باختراق الخلية بالكامل.

بعد خمس دقائق ، أضف برفق ثلاثة ملليلتر من الوسط الغضروفي إلى طبق بتري وأعد السقالات إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة أربعة أيام للسماح للخلايا بالهجرة عبر مسام السقالة. في نفس اليوم ، قم أيضا بزرع مجموعة أخرى من السقالات مع 2 في 10 إلى 6 الخلايا الجذعية المسماة كما هو موضح واحتضان الخلايا بدون المغناطيس للحصول على سقالات مصنفة بشكل موحد كضوابط إيجابية. من أجل تكوين الغضروف في سقالات في اليوم الخامس ، قم بإزالة الجهاز المغناطيسي من جميع السقالات وأعد السقالات الثابتة إلى حاضنة زراعة الخلايا حتى اليوم 25 ، وقم بتغيير الوسط مرتين في الأسبوع.

لثقافة الخلايا الديناميكية أيضا في اليوم الخامس قطع أنابيب السيليكون إلى الطول المناسب وفقا لتعليمات الشركات المصنعة وتسريع الأنابيب, ال 500 ملليلتر ثقافة غرفة الدوارات ثنائية الاتجاه والأقفاص في محطة سلامة ميكروبيولوجية معقمة. باتباع تعليمات الشركات المصنعة ، قم بتوصيل الأنبوب بالدوارات ذات الاتجاهين في غرفة الثقافة. ثم استخدم ملعقة معقمة لنقل سقالتين خلويتين بعناية إلى كل قفص.

عندما يتم نقل جميع السقالات ، أدخل الأقفاص من خلال الإبر الموجودة في الغطاء لمنعها من الحركة أثناء الدوران. واملأ غرفة الثقافة بوسط غضروفوني. استخدم تقنية مطهر معقمة عند تحضير الغرف لتجنب تلوث أي من الأدوات أو السقالات.

بعد ذلك ، أدخل الأقفاص في الغرفة ثم أغلق الغرفة وقم بتشغيل المضخة التمعجية لملء الأنبوب بوسط غضروفي والقضاء على فقاعات الهواء. ضع الغرفة المملوءة وقم بتثبيتها داخل محرك المفاعل الحيوي وقم بتشغيل الكمبيوتر الذي يتحكم في دوران الذراع والغرفة. ثم قم بتطبيق سرعة دوران من خمس دورات في الدقيقة على كل من الذراع والغرفة ، واضبط المضخة التمعجية على معدل تدفق يبلغ 10 دورات في الدقيقة للتغذية المستمرة للسقالات الخلوية.

لإنشاء سقالة مجانية 3D بناء الركام في اليوم الثامن ، ابدأ الاندماج عن طريق وضع اثنين من الركام على اتصال في وسط غضروفي إلى ثمانية دوبليت. ثم في اليوم 11 ، ادمج دوبلتين لتشكيل أربعة توائم رباعية ، وتشكيل الهيكل النهائي في اليوم 15 عن طريق دمج التوائم الرباعية الأربعة. تظهر الأنسجة المتكونة من الاندماج المغناطيسي زيادة كبيرة في تعبير الكولاجين II مقارنة بالكريات التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي.

مع زيادة اتجاه التعبير التجميعي. بالنسبة للسقالات الثابتة الخلوية والزيادة في تعبيرات التجميع والكولاجين II عند استخدام البذر المغناطيسي ، مقارنة بالسقالة المصنفة بدون قوى مغناطيسية. ومن المثير للاهتمام أن التعبير عن الكولاجين II يكون أعلى بكثير عندما يتم الجمع بين البذر المغناطيسي والتمايز الديناميكي.

يكشف التحليل النسيجي باستخدام تولويدين الأزرق أن الاندماج المغناطيسي المتسلسل ل 16 الركام يظهر ترسب وفرة من جليكان الجلوكوزامين. علاوة على ذلك ، في السقالات المصنفة مغناطيسيا ، يكون محتوى الجلوكوزامين جلاكان أعلى عندما يتم تمييز السقالات في مفاعل حيوي مما هو عليه عندما يتم زراعتها بشكل ثابت. بمجرد إتقان ، يمكن إكمال تجميع الخلايا المغناطيسية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعادة تعليق الخلايا المسماة في أصغر حجم ممكن لتسهيل تكوين المجموع. بعد البذر المغناطيسي للسقالات ، يمكن إجراء النضج الديناميكي باستخدام المفاعل الحيوي الفعلي لتحسين التعبير عن الخلايا الغضروفية المركبة الجديدة. منذ تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب التجديدي لاستكشاف تجديد الغضروف المفصلي لدى البشر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء الأجهزة المغناطيسية ، وتسمية الخلايا الجذعية ، وتشكيل مجاميع الخلايا الجذعية ، وسقالات البذور مغناطيسيا ، واستخدام مفاعل حيوي فعلي. لا تنس أن العمل مع الخلايا والأنسجة البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر والنظارات الواقية.