تحليل فصل الكروموسوم، هيستون أستيلاتيون، و مورفولوجيا المغزل في البويضات الحصان

تتمثل الأهداف العامة لهذا النهج التجريبي ، أولا ، في توصيف بويضات الخيول شكليا وكيميائيا حيويا ، وثانيا ، مقارنة الأمشاج من نفس التي تمت معالجتها في المختبر أو في الجسم الحي. يمكن أن يساعد هذا النهج التجريبي في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا البويضات والخصوبة في الأنواع أحادية الإباضة. قد يحسن أيضا سلامة إجراءات التلاعب بالأمشاج.

تم تطوير هذا النهج للتغلب على التوافر المحدود للعينات من البويضات ، خاصة من الأنواع أحادية الإفتاذ. سيظهر إجراءات OPU البروفيسور ستيفان دولوز من جامعة لييج ، وسيسيل دويت ، مديرة مختبري ، وفابريس رينر ، مدير وحدة الخيول في مركز INRA Val de Loire. على أساس يومي ، قم بتقييم قطر بصيلات المبيض في مجموعة من الأفراس البالغة باستخدام الموجات فوق الصوتية.

ابحث عن بصيلة كبيرة يزيد قطرها عن 33 ملم. بمجرد العثور عليها ، استعد لحقن 1،500 وحدة من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية للحث على نضوج البويضة في جريب سائد. بعد ذلك ، حدد موقع الأخدود الوداجي ، ومسح موقع الحقن بالكحول.

بعد ذلك ، لجعل الوريد يرتفع ، استخدم بعض القوة على بعد سنتيمترين أو ثلاثة سنتيمترات تحت موقع الحقن. أدخل الإبرة بالتوازي تقريبا مع الرقبة ، واستنشق قليلا للتأكد من أن الإبرة في الوريد ، وحقن الهرمون. قم بإعداد مسبار الموجات فوق الصوتية للوصول المهبلي.

ثم قم بتوصيل الإبرة بنظام الشفط. بعد 35 ساعة من حقن قوات حرس السواحل الهايتية ، قم بإعداد أجهزة OPU ، وتخدير الفرس. التسكين الجيد مهم للغاية لسلامة والمشغل.

سيسمح الذي لا يشعر بالألم أو الانزعاج بالتلاعب بالمبيض ، مما يجعل الثقوب والتدفق أسهل في الأداء. بمجرد إدخال مسبار الإبرة ، يجب على أحد المشغلين معالجة المبيض لمواجهة المسبار بينما يتلاعب المشغل الآخر بالإبرة. حدد موقع المسام السائد في صورة الصدى.

بعد ذلك ، استخدمي الإبرة لثقب جدار المهبل وجدار الجريب السائد. بمجرد الوصول إلى مساحة البصيلات ، استنشق السائل الجريبي. قم بتدوير الإبرة لكشط الجدار الجريبي وإرفاق مركب البويضات الركامية.

ثم صب السائل في طبق بتري كبير. وتحت المجسم ، ابحث عن COC. في هذه الأثناء ، اغسل المسام باستخدام PBS المعدل الدافئ من Dulbecco الذي يحتوي على الهيبارين.

قد يستغرق الأمر عدة تدفقات لجمع COC. بعد العثور على COC ، قم بتغيير الإبرة إلى إبرة مزدوجة التجويف واجمع COCs غير الناضجة من جميع البصيلات التي يتراوح قطرها بين خمسة و 25 ملم. سيتم استخدامها للنضج في المختبر.

بمجرد شفط جميع البصيلات من مبيض واحد ، كرر نفس الإجراءات لجمع COCs غير الناضجة من المبيض الآخر. الآن ، اختر من بين COCs. احتفظ فقط ب COCs مع عدة طبقات كاملة من الخلايا الركامية وأوبلازم بني حبيبات ناعم.

تجاهل الآخرين. في نهاية الإجراء ، قم بحقن الفرس ب 15،000 وحدة من البنزيل البنسلين لمنع العدوى. بعد ذلك ، ضع الفرس في إسطبل هادئ ونظيف لمدة ساعتين على الأقل أثناء تعافيها.

قبل أن يبدأ OPU ، قم بتسخين زجاجة من TCM-199 المكمل المكمل ب HEPES إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد وسيط IVM. قم بتوزيع 500 ميكرولتر من TCM-199 المكملة ببيكربونات الصوديوم في آبار طبق من أربعة آبار.

ثم احتضن الطبق عند 38.5 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. انقل COCs غير الناضجة المستردة إلى طبق بطول 3.5 سم مملوء بملليلترين من HEPES TCM-199 الدافئ. انقل COCs عبر مناطق مختلفة من الطبق لغسل الحطام المحيط برفق.

الآن ، انقل COCs إلى وسط IVM ، واحتضنها لمدة 28 ساعة عند 38.5 درجة مئوية. لإجراء حساب الكروموسومات على COCs الناضجة ، قم باحتضانها في موناسترول 100 ميكرومولار لمدة ساعة عند 38.5 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الخلايا الركامية عن طريق معالجة COCs بنسبة 0.5٪ هيالورونيداز في TCM-199 المخزن إلى HEPES.

راقب هذا التفاعل على مرحلة ساخنة مضبوطة على 38 درجة مئوية. في غضون خمس دقائق تقريبا ، قم بإزالة جميع الخلايا. استخدم ماصة لطيفة لإزالة الخلايا القليلة الأخيرة العنيدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المنطقة الشفافة باستخدام 0.2٪ بروناز في TCM-199 المخزن مؤقتا ب HEPES. راقب رد الفعل هذا على مرحلة ساخنة أيضا. يجب أن يستغرق الأمر حوالي خمس دقائق حتى يكتمل.

بعد ذلك ، قم بإصلاح البويضات في 4٪ بارافورمالدهيد في DPBS لمدة 15 دقيقة عند 38.5 درجة مئوية ، تليها 45 دقيقة أخرى من التثبيت عند أربع درجات مئوية. بعد التثبيت ، اغسل البويضات عن طريق نقلها بالتتابع بين ثلاثة آبار من 0.1٪ كحول بولي فينيل في DPBS. استخدم حوالي نصف مل من المحلول لكل بئر.

بعد ذلك ، انقل البويضات إلى بئر مملوء بنسبة 0.3٪ Triton X-100 في PBS ، واتركها تحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لمنع الإشارات غير المحددة ، استحم الخلايا في DPBS بمصل 1٪ BSA و 10٪ مصل الحمار العادي. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

بعد 30 دقيقة ، ضع الجسم المضاد الأساسي ، ثم احتضن الخلايا عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، اغسل البويضات ، وقم بتطبيق الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، محميا من التعرض للضوء. بعد تطبيق الثانوية ، اغسل البويضات مرة أخرى.

بعد ذلك ، قبل التركيب ، قم بتوصيل شرائط الشريط على الوجهين بالشرائح لتكون بمثابة دعامات للغطاء. الآن ، قم بتركيب البويضات من ثلاثة إلى أربعة لكل شريحة في قطرة من وسط التركيب غير المتصلب والمضاد للبهتان مع 20 ميكرومولار من YO-PRO-1. اترك البويضات تستقر لمدة 10 دقائق ، ثم ضع الغطاء.

من بين 32 COCs تم استردادها بواسطة OPU من البصيلات السائدة ، كان 28 في الطور الثاني ، وباستخدام النضج في المختبر ، تم نضج 37 من أصل 44 COCs التي تم جمعها من البصيلات غير المهيمنة إلى الطور الثاني ، ثم تمت مقارنة كروموسومات كلا المجموعتين. غالبا ما تتأثر البويضات الناضجة في المختبر باختلال الصيغة الصبغية ، ومعظمها تضخم الصيغة الصبغية لم يلاحظ هذا في البويضات الناضجة في الجسم الحي.

بعد ذلك ، تم قياس طول المغزل من قطب إلى قطب وقطر المغزل عند الحد الأقصى. كانت البويضات الناضجة في المختبر أطول بكثير وأوسع بكثير من البويضات الناضجة في الجسم الحي. في نفس العينات ، تم قياس مستوى الأستلة العالمي ل H4K16.

كانت النتائج كما هو متوقع. كان أستيل H4K16 أقل بكثير في البويضات الناضجة في المختبر منه في البويضات الناضجة في الجسم الحي. يمكن لفريق مدرب جيدا معالجة خمس فراس في صباح واحد من OPU بمعدل استرجاع 80٪ للبويضة السابقة للإباضة و 50 إلى 60٪ من استرجاع البويضات غير الناضجة.

أثناء OPU ، راقب دائما ورفاهيته ، وكن مستعدا لتقديم الرعاية البيطرية الكافية إذا لزم الأمر. يمكن تطبيق النهج التجريبي على بويضات الأنواع الأخرى أيضا وهو قابل للتطبيق بشكل خاص عندما يكون توافر العينات مشكلة ، كما هو الحال مع البشر. بناء على نتائجنا ، يجب إجراء دراسات لفهم أفضل لظروف الثقافة اللازمة لفصل الكروموسومات الصحيح والتغيرات اللاجينية بشكل أفضل.

الهدف الشامل هو تحسين كفاءة النضج في المختبر لكل من الطب البيطري وعلاج الخصوبة البشرية.