عزل وتحليل خلايا البنكرياس اللحمة المتوسطة عن طريق التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا اللحمة المتوسطة البنكرياسية لتحليل التعبير الجيني وعلامات السطح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطور البنكرياس مثل الإشارات التي تعبر عنها الخلايا الوسيطة وكيف تؤثر على التطور الظهاري. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها بسيطة وسريعة نسبيا ، وأنها تسمح بعائد جيد من الخلايا المصنفة.

ابدأ بإيداع الأعضاء الداخلية في طبق استزراع يحتوي على HBSS ووضع الطبق تحت مجهر استريو. افصل الكبد والكلى لكشف البنكرياس باستخدام ملقط دقيق لإزالة البنكرياس من المعدة والاثني عشر والطحال. عندما يتم جمع كل بنكرياس ، انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على عازلة هضمية معدة حديثا وضع الأنبوب على الثلج.

عندما يتم حصاد كل البنكرياس ، انقل الأنسجة إلى كتلة تسخين 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التحريض عند 700 دورة في الدقيقة ، مع قلب الأنابيب يدويا ثلاث إلى أربع مرات بعد 15 دقيقة. إذا كانت القطع الكبيرة من البنكرياس لا تزال موجودة بعد النصف الأول من الهضم ، فقم بقلب الأنبوب كل خمس دقائق لمدة 15 دقيقة الأخيرة واحتضان الأنسجة لمدة خمس إلى 10 دقائق إضافية حسب الضرورة. في نهاية عملية الهضم ، ضع الأنابيب على الثلج وأضف 10 مل من HBSS البارد إلى كل عينة.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في ملليلترين من PBS الطازج. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصافي 35 ميكرون إلى خمسة مليلتر من أنابيب تجميع البوليسترين المستديرة القاع واغسل أنابيب الهضم بملليلترين من PBS الطازج لتصفية الغسالات في أنابيب التجميع المقابلة لها. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وشفط المواد الطافية بعناية دون إزعاج الكريات.

أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت للفرز وفقا لعمر وقم بتصفيتها من خلال مصافي خلايا جديدة 35 ميكرون في أنابيب تجميع جديدة بسعة خمسة ملليلتر. Aliquot 50 إلى 100 ميكرولتر من حجم الخلايا في أنابيب FACS جديدة لعناصر التحكم في التلوين بما في ذلك أنبوب لكل فلوروفور ، وصبغة الجدوى ، والبروتينات الفلورية ، والتحكم غير الملطخ. اغسل كل أنبوب بما يصل إلى أربعة ملليلتر من عازلة الفرز ثم جهاز الطرد المركزي.

بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في مخزن مؤقت للفرز الطازج وفقا لعمر. ثم تلطخ الخلايا بصبغة البقاء. لفرز الخلايا قبل استخراج الحمض النووي الريبي ، مباشرة قبل بداية الفرز ، قم بتغطية أنبوب تجميع معقم سعة 1.5 مليلتر بمليلتر واحد من مخزن الفرز الذي يحتوي على مثبط RNAse.

بعد خمس دقائق ، قم بتدوير أنبوب التجميع وإزالة السائل. دوامة أول عنصر تحكم في التلوين وتحميل الأنبوب في مقياس التدفق الخلوي لبدء تحديد معلمات الفرز. عندما يتم تعيين جميع معلمات الفرز ، قم بتحميل العينات وفرز الخلايا إلى أنابيب تجميع 1.5 ملليلتر.

ثم اجمع الخلايا التي تم فرزها عن طريق الطرد المركزي. قم بشفط المادة الطافية وصولا إلى الحبيبات واستخرج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي القياسية. هنا ، يتم عرض الجهاز الهضمي الكامل المعزول بما في ذلك المعدة والطحال والأمعاء والبنكرياس لجنين اليوم الجنيني 15.5 وجرو ما بعد الولادة.

يكشف تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المفردة من أنسجة البنكرياس الجنينية وحديثي الولادة والبالغين المعزولة كما هو موضح للتو أن أنسجة البنكرياس المعدلة وراثيا من جميع الأعمار التي تم تحليلها تحتوي على مجموعات خلايا مميزة تحمل علامة YFP. بعد الفرز ، يمكن زراعة هذه الخلايا اللحمية المتوسطة لإنشاء خط خلوي لخمسة ممرات على الأقل. لاحظ التشكل الليفي للخلايا المستنبتة النموذجية للخلايا الوسيطة.

تعبر الخلايا المصنفة عن فيمنتين علامة اللحمة الخام ، كما تم تحليلها بواسطة qPCR بعد استخراج الحمض النووي الريبي وتخليق (كدنا). علاوة على ذلك ، يشير تعبير علامة سطح الخلية البنكرياس المعزولة إلى أن جميع الخلايا المصنفة بالفلورسنت في بنكرياس YFP المعدلة وراثيا تعبر عن CD9 ، وهو بروتين سكري على سطح الخلية يقال إنه يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا الليفية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير الجيني للخلية الوسيطة.