إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذه التجربة هو الحصول على تلطيخ مناعي موثوق به لأنسجة المخ غير الرئيسيات للفحص المجهري الإلكتروني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التشريح العصبي ، مثل الحدوث المشبكي لتعصيب معين في بنية دماغية دقيقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سهلة ومنخفضة التكلفة لتسمية أعصاب معينة مناسبة للفحص المجهري الإلكتروني.

ابدأ بنقل أقسام بسمك 50 ميكرون من دماغ الرئيسيات غير البشري الثابت الذي يحتوي على منطقة الاهتمام إلى صفيحة 12 بئر تحتوي على PBS. اغسل الأقسام العائمة الحرة ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضن الأقسام في محلول بوروهيدريد الصوديوم المحضر حديثا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صخور بلطف بدون غطاء.

بمجرد انقضاء 30 دقيقة ، قم بشفط بوروهيدريد الصوديوم وأضف PBS إلى كل بئر. ضع الطبق على كرسي هزاز ورجه بقوة لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل مرتين أخريين أو حتى لا يتبقى أي من غاز التفاعل.

قم بسد الأقسام عن طريق احتضانها في محلول من مصل 2٪ عادي و 0.5٪ جيلاتين السمك البارد المخفف في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم باحتضان الأقسام في محلول الجسم المضاد الأولي مع هزاز لطيف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، بعد غسل الأقسام كما كان من قبل ، احتضان الأقسام في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة ونصف في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.

بعد غسل الأقسام كما كان من قبل ، احتضن في محلول أفيدين-بيوتين-بيروكسيداز أو ABC لمدة ساعة واحدة مع الهزاز. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول جديد بنسبة 0.05٪ 3 ، 3'ديامينوبنزيدين مع 0.005٪ بيروكسيد الهيدروجين المخفف في TBS. بعد الغسيل ، احتضان الأقسام في محلول DAB لمدة ثلاث إلى سبع دقائق مع هزاز لطيف.

بمجرد أن يتطور الراسب البني إلى اللون المطلوب ، أوقف التفاعل عن طريق الغسيل السريع مرتين في TBS البارد ، ثم من خلال سلسلة من غسلات TBS و PB الموقوتة. انقل اللوحة التي تحتوي على الأقسام الملطخة ب DAB إلى غطاء التهوية. انقل الأقسام إلى صفيحة من ستة آبار مملوءة ب PB وقم بتسطيح الأقسام تماما عن طريق سحب PB بعناية من اللوحة ، ثم أضف محلول رابع أكسيد الأوزميوم قطرة قطرة لتجنب إزعاج الأقسام المسطحة.

قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لحماية الأقسام من الضوء واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. أثناء التناضح ، قم بإعداد راتنجات الايبوكسي الطاردة للماء عن طريق إضافة كميات مناسبة من كل مكون من مكونات مزيج راتنجات الايبوكسي إلى كوب بلاستيكي كبير. قلبي بعصا خشبية أو ماصة بلاستيكية حتى يتم الحصول على لون بني متجانس ، ثم انقل كميات متساوية من الراتنج إلى أكواب من الألومنيوم بحجم مناسب لعدد الأقسام المراد معالجتها واتركها ترتاح.

بمجرد انقضاء فترة التذبذب ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في PB لمدة 10 دقائق مع هزاز منخفض السرعة. بعد الغسيل ، قم بتجفيف الأقسام في السلسلة التالية من الإيثانول المتدرج لمدة دقيقتين لكل منهما. بعد ذلك ، انقل الأقسام إلى قوارير زجاجية مملوءة بأكسيد البروبيلين واحتضانها في أكسيد البروبيلين ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منهما لإكمال عملية الجفاف.

ثم انقل الأقسام بعناية ، واحدة تلو الأخرى ، إلى أكواب الألمنيوم ، وتجنب ملامسة الهواء قدر الإمكان. قم بتضمين الأقسام بشكل مسطح في راتنجات الايبوكسي المختلطة مسبقا واحتضانها طوال الليل تحت غطاء التهوية في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، قم بتغطية الشرائح الزجاجية والغطاء البلاستيكي بالزيت المعدني ، ثم قم بتليين الراتنج عن طريق احتضان أكواب الألمنيوم عند 60 درجة مئوية لمدة 12 إلى 15 دقيقة على الالأكثر

بتسطيح الأقسام الموجودة على الجانب المدهون من الشريحة الزجاجية بعناية. ضع زلة الغطاء المدهونة بالزبدة وادفع أي هواء متبقي للخارج بحذر. احتضن الشرائح عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

بعد 48 ساعة ، قم بإزالة زلة الغطاء البلاستيكي ، واترك القسم مغطى بالراتنج. ابدأ باستخدام المناظير لتحديد منطقة الاهتمام ثم استخدم مشرطا لقطع قطعة صغيرة رباعية الزوايا من الأنسجة يبلغ حجمها حوالي مليلتر واحد مربع. بعد ذلك ، قم بحفظ طرف كتلة الراتنج ثم قم بلصق قطعة الأنسجة رباعية الزوايا عليها.

بعد التجفيف ، ضع كتلة الراتنج في سطح الميكروتوم الفائق في الوضع الرأسي واستخدم شفرة حلاقة حادة لقطع كل جانب من جوانب الراتنج تدريجيا لتشكيل شبه منحرف بجوانب ناعمة. بعد ذلك ، ضع السطح في موضعه الأفقي وقم بتدوير الكتلة حتى يتجه أطول جانب من شبه المنحرف لأسفل. ضع أداة تشذيب ماسية أو سكين زجاجي في مساحة مخصصة.

اضبط الميكروتوم الفائق لقطع أقسام 300 ميكرون بمعدل ملليمتر واحد في الثانية. اضبط السكين ليكون موازيا عموديا للقطعة الرباعية الزوايا ولعرض زاوية أفقية صغيرة جدا تبلغ درجة واحدة تقريبا وقم بقص سطح القطعة الرباعية الزوايا حتى يبدأ النسيج في الظهور. الآن ، قم بالتبديل إلى سكين ماسي بزاوية 45 درجة مزودا بقارب مملوء بالماء المقطر لقطع أقسام بسمك 80 ميكرون.

بتنعيم الأقسام عن طريق تجاوزها بقطعة من ورق الامتصاص مائلة بالزيلين دون لمس سطح الماء ، وجمع الأقسام التسلسلية على 150 شبكة نحاسية عارية. ضع الشبكات في صندوق تخزين شبكي ثم قم بإعداد محلول واحد لواحد من محلول مخزون سترات الرصاص والماء المقطر والفلتر من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون. غطي القارورة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء.

ضع كل شبكة على قطرة من محلول سترات الرصاص المخفف ، مع ملامسة القسم للمحلول ثم استخدم ملاقط صغير لتثبيت الشبكة وشطفها جيدا في كوبين يحتويان على الماء المقطر. قم بإزالة الماء الزائد برفق باستخدام ورق الامتصاص وضع الشبكات في صندوق شبكي. بعد 30 دقيقة ، يمكن فحص الأقسام عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال.

يظهر هذا الرسم المجهري الإلكتروني لقرد السنجاب الداخلي للكرة الجحوبة مادة محفوظة جيدا بعد نضح الأكرولين PFA عبر القلب في تقنية إيمونوبيروكسيديز ديامينوبنزيدين. كما هو موضح هناك ، يسمح الإجراء برؤية غمد المايلين لمحور عصبي كبير ، يشار إليه برأس السهم. يوضح هذا الرسم المجهري الإلكتروني للكرة الشاحبة الخارجية الملامح التغصنية ، المشار إليها بالحرف d ، ويمكن بسهولة التعرف على المحاور الصغيرة غير الميالينية ، المشار إليها ب a ، والدوالي المحورية ، المسماة av.

تظهر الأسهم مثالا على دوالي محورية تؤسس اتصالا متشابها متماثلا مع المظهر التغصني. يمكن التعرف بسهولة على العناصر ذات العلامات المناعية من خلال السيتوبلازم أو الأكسوبلازم المملوء براسب DAB كثيف الإلكترون. هنا ، يتلقى التغصنات المناعية لأسيتيل ترانسفيراز الكولين في GPi اتصالا متشابكا من دوالي محور عصبي غير مسمى.

يظهر هذا الرسم المجهري الإلكتروني محورا عصبيا نخاعا في GPe مع غمد مايلين سليم نسبيا تم تصنيف أكسوبلازم عليه مناعة لهيدروكسيلاز التيروزين. يوضح هذا المثال دوالي محورية في GPi المناعية لناقل السيروتونين الذي يؤسس اتصالا متشاككا متماثلا مع التغصنات. في هذا المثال ، يبطن راسب DAB غشاء البلازما والسطح الخارجي للعضيات.

لوحظت الدوالي المحورية الموضحة هنا في GPe وتم تصنيفها مناعية لهيدروكسيلاز التيروزين. يمثل هذا مثالا على ترسيب DAB الذي يملأ الأكسوبلازم بالكامل ، مع ظهور الحويصلات المشبكية ولكن يصعب تحديدها. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التضمين المسبق للكيمياء المناعية المزدوجة للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد موقع البروتينات أو المستقبلات على المستوى المشبكي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الكيمياء المناعية المسبق للتضمين لأنسجة المخ غير الرئيسيات ، والمضي قدما في التضمين في راتنجات الايبوكسي ، وتقطيع منطقة الاهتمام إلى أقسام بسمك 80 ميكرومتر مناسبة للفحص المجهري الإلكتروني.