باستخدام كامل-- جبل المناعية طريقة لدراسة التعصيب من القناة الصفراوية في سونكوس مورينوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تلطيخ الكيمياء المناعية الكاملة لتصور توزيع الأعصاب داخل القناة الصفراوية ل Suncus murinus. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل التوزيع العصبي للأعضاء الحشوية للعديد من الأنواع ، وخاصة الأعضاء غير المنتظمة أو الصغيرة التي يصعب تقييمها بالطرق القياسية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن العملية بسيطة.

لا يتطلب إجراءات معقدة وله معدل نجاح مرتفع. سيعرض الإجراء معي Yidan Dai ، طالب دراسات عليا ، و Shuang-Qin Yi ، زميل باحث ، وكلاهما من مختبري. ابدأ بغسل باستخدام PBS الفردي و 4٪ من نضح بارافورمالدهايد في خزانة الدخان.

ثم حقن ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من لاتكس النيوبرين الأبيض من خلال قسطرة التروية في الشريان الأورطي البطني لتسمية الأوعية الدموية. وعندما يتم وضع علامة على جميع الأنسجة ذات الأهمية ، استخرج أعضاء البطن والأعصاب والأوعية ذات الصلة. ثم قم بحقن ما يقرب من 0.1 مل من اللاتكس النيوبرين الأزرق في المرارة لتسمية الجهاز الصفراوي وإصلاح الأنسجة بعد ذلك في 4٪ بارافورمالدهايد بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية للتلوين المناعي بالكامل.

في صباح اليوم التالي ، انقل العينة إلى قارورة زجاجية لمدة أربع مرات غسل بدرجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الماء المقطر على مغذية. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الأنسجة في حمض تقويم العظام الطازج 1٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع أي تفاعلات جوهرية للبيروكسيداز. بعد ذلك ، اغسل العينة بالماء المقطر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بحضانة في بابيلون طازج 0.004٪ لمدة ساعتين في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف.

في نهاية الحضانة ، اغسل العينة بالماء المقطر لمدة 50 إلى 60 دقيقة. ثم قم بتخزين الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اغسل العينة بالماء المقطر كما هو موضح للتو متبوعا بحضانة أخرى لمدة ساعتين في بابيلون طازج.

اغسل العينة لمدة 50 إلى 60 دقيقة أخرى في ماء مقطر ، متبوعا بالتثبيت طوال الليل في 4٪ بارافورمالدهايد. في صباح اليوم الثالث ، اغسل المناديل أربع مرات في الماء المقطر ، متبوعا بالغمر في ثلاث حضانات سكروز تصاعدية متتالية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتجميد العينة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 إلى 60 دقيقة ، متبوعا بالذوبان الكامل في درجة حرارة الغرفة.

بعد دورة التجميد والذوبان الثالثة ، انقل العينة إلى 2٪ Triton X-100 لمدة أربع درجات مئوية لحضانة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، انقل العينة إلى وعاء من الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام للهزاز اللطيف على المغذي عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة إلى ستة أيام وفقا لحجم العينة. بعد فترة وضع العلامات المناسبة ، قم بإزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط بأربع غسلات لمدة ساعة واحدة في PBS في درجة حرارة الغرفة وقم بتسمية العينة بالجسم المضاد الثانوي المناسب لمدة ثلاثة أيام مع هزاز لطيف عند أربع درجات مئوية.

في نهاية فترة وضع العلامات على الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل العينة أربع مرات في PBS. ثم احتضان الأنسجة في 10 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين في 100 مل من محلول التلوين الطازج 0.002٪ DAB عند أربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 72 ساعة مع هزاز لطيف. عند الوصول إلى شدة التلوين المثلى ، انقل العينة إلى 0.04٪ أزيد الصوديوم في PBS لإيقاف تفاعل التلوين.

ثم اغمر العينة بعناية في طبق بتري بطول 10 سم يحتوي على PBS طازج والتقط صورا كاملة للأنسجة باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر استريو. بالإضافة إلى تصور تعصيب القناة الصفراوية خارج الكبد ، فإن وضع العلامات بالجسم المضاد ضد الألياف العصبية الإيجابية للخيوط العصبية يسمح أيضا بتحديد لا لبس فيه لكثافة تشغيل وتوزيع العصب المبهم على طول المريء وفي المعدة. يكشف تسمية الأوعية الدموية للمرارة بلاتكس النيوبرين الأبيض عن التليف العصبي الرقيق في تناقض كبير مع الأنسجة المحيطة مع كثافة أعلى من التعصيب التي لوحظت في عنق المرارة مقارنة بقاع القاع.

في القناة الصفراوية العلوية ، يتم تصنيف نوعين من الحزم العصبية ، الحزم العصبية الدقيقة التي تشكل شبكة غير منتظمة وكثيفة من الأعصاب وتعمل بشكل لاصق على القناة الصفراوية وفي القناة الصفراوية والحزم العصبية السميكة التي يتم توزيعها بالتوازي مع سطح القناة الصفراوية. يسمح وضع العلامات على القناة الصفراوية المشتركة بلاتكس النيوبرين الأزرق والأوعية التي تحتوي على لاتكس النيوبرين الأبيض بتصور الألياف العصبية الرقيقة في نهاية القناة الصفراوية المشتركة ومنطقة الحليمة الاثني عشر. قبل محاولة هذا الإجراء ، احرص على تشغيل الجدول الزمني لكل تجربة لأن العملية برمتها تتطلب أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع حتى تكتمل.

لتجنب إتلاف العينة عند تغيير المحاليل ، اسكب المحاليل دائما بدلا من إزالة العينة بالملقط. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على تطبيق هذه التقنية على وضع العلامات على مجموعة من الأعصاب داخل الأعضاء الحشوية المختلفة.