تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

الهدف العام من تقنية القياس الخلوي الطيفي هذا هو التمييز بين الفلوروكرومات المختلفة باستخدام أطياف الانبعاثات الكاملة. علاوة على ذلك ، يتيح هذا البروتوكول تنفيذ التألق الذاتي كمعامل مستقل ، مما يسمح بالتحليل المناسب للخلايا المعزولة من الأعضاء الصلبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم المناعة وتطوير بيولوجيا الخلايا الجذعية مثل كيفية التعرف على مجموعات الخلايا النادرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قدرتها الفريدة على تحليل عدد كبير من المعلمات في وقت واحد ، وإدارة التألق الذاتي للأنسجة الصلبة. على الرغم من أن هذه الطريقة تستخدم لتحضير معلق خلية واحدة مشتق من الأمعاء والقلب ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أعضاء أخرى ، مثل الرئة والهيكل العظمي والعضلات والكبد والدهون والكلى. للبدء ، قم بعزل وغسل الأمعاء الدقيقة من الفأر البالغ.

بعد ذلك ، ضع المنديل على منشفة ورقية ، وباستخدام مقص حاد ، قم بإزالة بقع باير بعناية. افتح الأمعاء عن طريق قطعها طوليا وقسمها إلى قطع سنتيمتر واحد. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى دورق مملوء ب 30 مل من HBSS مكملا بنسبة عشرة بالمائة FCS ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع التحريك المستمر لمدة 30 دقيقة.

بمجرد اكتمال الحضانة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 مليلتر وقم بدوامه بقوة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، احتضن المعلق على الجليد لمدة عشر دقائق للسماح للشظايا الكبيرة غير المنفصلة بالترسيب. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتدوير الخلايا عند 120 مرة G لمدة سبع دقائق.

بمجرد الحبيبات ، نقوم بتعليق الخلايا في عشرة ملليلتر من واحد بالمائة FCS في HBSS ونقوم بحسابها باستخدام غرفة Neubauer. قبل تلطيخ الخلايا ، انقل مرة في عشرة إلى الخلايا المعوية السادسة إلى أنبوب خمسة ملليلتر لإعداد تحكم سلبي. لتحضير عينة ، أضف مرة واحدة عشرة إلى سادس الخلايا المعوية ، متبوعا بملليلترين من HBSS مع واحد بالمائة FCS إلى أنبوب جديد خمسة ملليلتر وقم بالطرد المركزي المعلق عند 120 مرة G ، عند أربع درجات مئوية ، لمدة خمس دقائق.

بعد التخلص من المادة الطافية ، نعلق الخلايا في 50 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة. لف رقائق الألومنيوم الأنبوبية واحتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بمجرد اكتمال الحضانة ، أضف ملليلترين من واحد بالمائة FCS في HBSS إلى العينة وقم بطردها عند 120 مرة G، أربع درجات مئوية، لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر محلول يوديد بروبيديوم. بعد قطع رأس جنين الفأر ، انقع جسمه في طبق بتري ، مبطن بمنشفة ورقية مبللة مسبقا ، ومملوء ب 50 مل من واحد بالمائة FCS في HBSS. تحت المجهر المجسم ، قم بعمل شق على الجانب الأيمن من صدر الجنين وافتح الصدر بعناية ، وتجنب إتلاف القلب.

استولى على الأوعية الكبيرة واسحب القلب المتصل بالرئتين والغدة الصعترية. انقل الأعضاء إلى طبق بتري سعة 35 ملليلتر مملوء بملليلترين من واحد بالمائة FCS في HBSS. بعد ذلك ، اعزل القلب عن الأعضاء المحيطة والأنسجة الضامة.

بعد غسل القلب ، انقعه في مليلتر واحد من المحلول الأنزيمي الدافئ مسبقا ، وباستخدام ملقط ناعم ومشرط ، قم بفرم العضو إلى قطع ملليمتر مكعب واحد تحت مجهر مجسم. أضف ملليلترا إضافيا واحدا من المحلول الأنزيمي الدافئ مسبقا وانقل الأنسجة المجزأة إلى أنبوب مغطى بسعة خمسة ملليلتر. احتضان العينة في وضع أفقي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بتجانس الأنسجة عن طريق سحب العينات المتكررة للتعليق باستخدام ماصة P1000. ثم ضع العينات ، في وضعها عموديا ، جانبا حتى تترسب شظايا الأنسجة غير المهضومة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 50 مل.

أضف ملليلترين من عشرة بالمائة FCS في HBSS واحتفظ بالخلايا المعزولة على الجليد. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من المحلول الأنزيمي الدافئ مسبقا إلى أنبوب الخمسة ملليلتر الذي يحتوي على رواسب الأنسجة غير المهضومة ، واستمر في هضم الأنسجة كما هو موضح سابقا حتى لا يتم ملاحظة أي أنسجة متبقية. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية التي تم الحصول عليها عند 120 مرة G لمدة عشر دقائق.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من واحد بالمائة FCS في HBSS ، خالية من كاتيونات الكالسيوم والمغنيسيوم. لتلطيخ خلايا القلب ، قم بنقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى آبار من صفيحة بئر 96 قاعية. قم بالطرد المركزي للوحة عند 480 مرة G لمدة دقيقة واحدة وتخلص من المادة الطافية.

بعد ذلك ، أعد تعليق خلايا القلب في 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها على أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بمجرد اكتمال الحضانة ، اغسل خلايا القلب ب 200 ميكرولتر من واحد بالمائة FCS في HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم ، وقم بالطرد المركزي للتعليق عند 480 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من واحد بالمائة FCS في HBSS خال من الكالسيوم وأيون المغنيسيوم ، ونقل المعلق إلى أنبوب خمسة ملليلتر مملوء مسبقا ب 200 ميكرولتر من واحد بالمائة FCS في HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. أخيرا ، أضف 400 ميكرولتر من واحد بالمائة FCS في HBSS خالية من كاتيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، والتي تحتوي على 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر من يوديد البروبيديوم وقم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 70 دقيقة. لتصور الخلايا ، قم بتحميل العينة الملطخة إلى قياس التدفق الخلوي وانقر فوق المعاينة ، ثم قم بتسجيل ما يصل إلى مرتين في عشرة إلى الأحداث السادسة في العينة بالنقر فوق اكتساب.

في علامة تبويب التحليل ، افتح نافذة منصة الألوان وسجل جميع المعلمات المدروسة عن طريق إضافة الفلوروكروم جنبا إلى جنب مع العلامة المقابلة له. تأكد من تضمين معلمات التألق الذاتي والجدوى. في نافذة التحكم ، داخل قائمة الأنابيب ، قم بتحليل أول عينة ملطخة واحدة تحتوي على حبات تعويض.

ثم ، في ورقة العمل ، انقر فوق أداة تصميم المضلع وقم ببوابة مجموعة الخرزة في مخطط FSC SSC. انقر نقرا مزدوجا فوق البوابة لإنشاء قطعة أرض ابنة من الخرز المسور. ثم بوابة الخرز الإيجابي والسلبي بشكل منفصل.

تحقق من السكان الولنة المختارة عن طريق البوابات المتتالية والقضاء على القيم المتطرفة في كل جزء إيجابي وسالب. بعد ذلك ، قم بتحميل البوابات السلبية والإيجابية في نافذة إلغاء الخلط. بعد ذلك ، حدد عينة الخلية غير الملوثة في قائمة الأنابيب وصمم بوابات منفصلة للخلايا الفلورية الذاتية وغير الفلورية الذاتية.

بمجرد تحديد البوابات السالبة والإيجابية لجميع المعلمات ، بما في ذلك التألق الذاتي والجدوى ، انقر فوق حساب. ثم قم بتطبيق إلغاء الخلط على العينات التي تم تحليلها. لتحليل البيانات ، قم ببوابة الخلايا في مخطط SSC مقابل FSC واستبعد الخلايا الميتة الملطخة بيوديد البروبيديوم.

أخيرا ، حدد البوابات لجميع السكان المهتمين. فيما يلي نتائج تحليل قياس التدفق الخلوي وتحليل القياس الخلوي الطيفي للخلايا المعزولة من قلب الجنين والملطخة بالأجسام المضادة ل TER119 و CD45 ومضادات Sca-1. تم الكشف عن مجموعة فرعية من خلايا التألق الذاتي بواسطة مقياسين خلوييين تقليديين بينما في القياس الخلوي الطيفي لم يتم تعريف هذه الخلايا على أنها ذاتية الفلورسنت وتألفت في مجموعة CD45 TER119 السلبية.

تم تحليل الخلايا التي تم تحديدها بواسطة قياس التدفق الخلوي التقليدي على أنها خلايا ذاتية الفلورسنت ، ولكن ليس خلايا إيجابية CD31 للتعبير عن النصوص الخاصة بخلايا عضلة القلب. تم العثور على مستويات عالية من التروبونين القلبي والخلايا العضلية الأذينية مثل نصوص القطارات في خلايا الفلورسنت الذاتي ، مما يؤكد أن مجموعة فرعية كبيرة من الخلايا العضلية القلبية مفقودة في قياس التدفق الخلوي التقليدي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ثماني ساعات ، إذا تم تشكيلها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد وفي قصر في الوقت المناسب لضمان بقاء الخلايا قابلة للحياة. بعد هذا الإجراء ، يمكن أن تكون البروتينات داخل الخلايا وتحليلات علامات السطح الإضافية من أجل الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالمسارات الجزيئية المحددة. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة وبيولوجيا النمو أو الخلايا الجذعية لاستكشاف وعزل مجموعات نادرة من أعضاء مختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا وتلطيخها من الأنسجة الخلوية ، وكيفية تحليل تعبير علامة السطح عن طريق قياس التدفق الخلوي الطيفي الذي يتغلب على القيود الناتجة عن التألق الذاتي للخلية. لا تنس أن العمل مع يوديد البروبيديوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.