العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا عضلة القلب القابلة للحياة والخلايا البطانية والخلايا الليفية في وقت واحد من قلب الفئران لتحليلاتها الفردية في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال القلب والأوعية الدموية حول آليات الإشارات التي ينطوي عليها تضخم القلب ، وإصابة نقص التروية ، ووظيفة البطانية ، والتليف القلبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عزل جميع خلايا القلب الرئيسية في وقت واحد ، مما قد يقلل من تكاليف البحث المرتبطة وأعداد التجريبية.

بعد واحد يقطر ماء وواحدة 50 ملليلتر [باول متوسطة] يتدفق ، يستبدل الوسط ب 80 ملليلتر من وسط باول طازجة ، واستعمل ماصة زجاجية باستور من الأسطوانة الزجاجية لبث الوسط باستمرار مع الكربوجين. بعد ذلك ، استخدم زوجين من الملقط المنحني الرفيع لتركيب قلب فأر تم حصاده حديثا عبر الشريان الأورطي على نظام نضح لانجندورف ، ووضع نهاية قنية نظام التروية بين فرع الأبهر الأول والصمام الأبهري. إصلاح الشريان الأورطي مع المشبك التمساح.

افتح صمام القنية ، ثم ثبت القلب بخياطة جراحية. اترك 35 ملليلترا من وسط التروية تمر عبر قطرة القلب ، وإزالة أي دم متبقي. ضع قمع التجميع تحت القلب ، وابدأ المضخة التمعجية لإعادة تدوير وسط التروية من قمع التجميع إلى الخزان.

أضف محلول الكولاجيناز إلى وسط التروية ، وقم بتنقيب القلب بمحلول الكولاجيناز المعاد تدويره لمدة 30 دقيقة. في نهاية عملية الهضم ، استخدم المقص لإزالة القلب من نظام Langendorff ووضعه في طبق بتري زجاجي. الآن قم بإزالة كل من الأذينين وأي بقايا من الأنسجة الدهنية من القلب.

لتجنب تلوث الخلايا الظهارية ، استخدم ملقطين لتقشير التامور بعناية. اقطع القلب من المنتصف ، وضع النصفين في مفرمة الأنسجة. افرم القلب مرتين إلى ثلاث مرات ، وانقل قطع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 12 مل من محلول الهضم من نضح لانجندورف.

هضم شظايا الأنسجة في حمام مائي لمدة خمس إلى 10 دقائق ، مع خلطها أحيانا بماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها خمسة ملليلتر. ثم قم بتصفية تعليق الخلية من خلال غربال 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل نظام التروية بما لا يقل عن لتر واحد من الماء المقطر متبوعا ب 100 مل من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسل النظام بلترات إلى ثلاثة لترات أخرى من الماء المقطر ، وجفف الجهاز بالهواء المتدفق.

اجمع الخلايا المفلترة عن طريق الطرد المركزي ، واستخدم ماصة يمكن التخلص منها لنقل الخلية البطانية والخلايا الليفية المحتوية على مادة طافية بعناية إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا. أعد تعليق الحبيبات في ستة ملليلتر من محلول الكالسيوم واحد. بعد دقيقة واحدة ، اجمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي الثاني ، وأعد تعليق الحبيبات في ستة ملليلتر من محلول الكالسيوم الثاني.

بعد دقيقة واحدة ، قم بتخفيف تعليق الخلية مع إضافة 12 مل من محلول الكالسيوم ثلاثة ، واخلطه جيدا عن طريق الإمالة اللطيفة. بعد طرد مركزي آخر ، أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من وسط CCT الدافئ مسبقا. ثم قم بنقل مليلتر واحد من الخلايا لكل من 20 طبقا معقما لزراعة الخلايا مقاس 35 ملم مغلفة مسبقا بطبقة من اللامينين ، وضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلايا الخالية من ثاني أكسيد الكربون ، واستبدل الوسط بملليلترين من وسط CCT الطازج لإزالة أي خلايا ميتة بعد ساعتين.

الآن الطرد المركزي للخلية البطانية والخلايا الليفية التي تحتوي على طافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1.5 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلايا البطانية. انقل الخلايا إلى أنبوب عينة سعة ملليلترين ، وأضف الجسم المضاد CD31 المضاد للفئران إلى الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع دوران من طرف إلى طرف. في نهاية الحضانة ، أضف حبات IGG المضادة للفأر لمدة 20 في الحضانة عند أربع درجات مئوية ، مع دوران من طرف إلى طرف.

في نهاية حضانة الخرزة ، ضع الخلايا في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين ، واستخدم ماصة سعة 1 مليلتر لإزالة الخلايا الطافية التي تحتوي في الغالب على الخلايا الليفية بعناية. شاهد الخلايا الليفية على طبق استزراع 10 سم يحتوي على 10 مل من وسط زراعة الخلايا الليفية ، وضع الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للغسيل إلى أنبوب الخلايا البطانية وقم بتغطية الأنبوب.

رج الخلايا برفق أربع إلى خمس مرات لتعليق الخرز. ثم أعد الأنبوب إلى المغناطيس ، وقم بإزالة مخزن الغسيل المؤقت بعد دقيقة واحدة. بعد الغسيل الأخير ، استبدل المخزن المؤقت للغسيل بمليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا البطانية MV2 ، وزرع الخلايا البطانية في بئر واحد من صفيحة 12 بئر ، لزراعتها بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الخلايا.

في نهاية حضانة الخلايا الليفية ، اغسل الخلايا المرفقة بحجم مناسب من PBS الدافئ مسبقا مرتين إلى ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف وسط زراعة الخلايا الليفية الطازجة المسخنة مسبقا إلى الخلايا ، وأعد الخلايا الليفية إلى حاضنة زراعة الخلايا. في صباح اليوم التالي ، استبدل المادة الطافية في ثقافة الخلايا البطانية بوسط زراعة الخلايا البطانية الطازجة ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة ، واستبدل الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام ، حتى شبه التقاء.

ثم اغسل مزرعة الخلايا الليفية المرفقة باستخدام PBS طازج مسخن مسبقا كما هو موضح للتو ، وقم بتغذية الخلايا بوسط جديد مسخن مسبقا. ينتج عن إجراء عزل خلايا عضلة القلب مجموعة خلايا قلبية نقية وقابلة للحياة على شكل قضيب ومخططة بنسبة 70 إلى 80٪. يمكن بعد ذلك إجراء تحليل تذبذب الكالسيوم داخل الخلايا لخلايا عضلة القلب المعزولة المحملة بالخلايا القلبية AM, استجابة لإعادة تروية نقص التروية في خلايا عضلة القلب ، وكذلك تحليل التغيرات في إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية المعزولة للحبة المغناطيسية والخلايا الليفية, بعد إضافة ATP.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم أداؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعداد نظام التروية هذا بشكل صحيح ، وإصلاح القلب على الفور في النظام بمجرد أن يصبح جاهزا. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية لاستكشاف الإشارات التي تنطوي عليها الفيزيولوجيا المرضية القلبية الوعائية المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للمبادئ الأساسية لعزل خلايا القلب وثقافتها. لا تنس أن العمل مع الأدوات الجراحية وكواشف زراعة الخلايا يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات ، مثل الاستخدام الدقيق للأدوات واستخدام القفازات يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.