زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وربط الأنسجة العصبية للفأر E17 ، من أجل زراعة وتسجيل وتحفيز الشبكات العصبية على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة ديناميكيات الشبكة ، من حيث صلتها بالآليات الأساسية للتعلم والذاكرة. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة قادرة على التسجيل من مواقع متعددة في وقت واحد ، وبالتالي يمكن أن توفر دقة مكانية وزمانية أفضل ، مقارنة بالماصة الزجاجية الأكثر تقليدية في تسجيل موقع واحد.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لديناميكيات شبكة التعلم والذاكرة ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا للتحقيق في سمية الأدوية أو تصميم نماذج للجيل التالي من الطب الشخصي. يعد العرض المرئي لهذه العملية أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم التلاعب بالأنسجة أثناء عملية التشريح والتفكك من مجرد قراءة البروتوكولات وحدها. لتحضير المصفوفة ، أضف 40 إلى 50 ميكرولترا من اللامينين المذاب إلى وسط كل MEA ، و 0.2 مل من اللامينين إلى لوحات التحكم ، باستخدام أطراف ماصة معقمة.

قم بتغطية جميع أطباق المتوسط وأطباق التحكم في الغطاء الحيوي ، وانقلها إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة، قم بإزالة اللامينين الزائد بعناية من وسط المتوسطات البيطرية باستخدام الشفط باستخدام ماصات باستور المعقمة، واترك السطح يجف في الهواء قبل الطلاء. بعد ذلك ، اسكب L-15 متوسطا في أربعة أطباق بتري مقاس 100 ملم ، وقم بتغطيتها ، وضعها في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 40 إلى 60 دقيقة ، حتى يصبح الوسط متناسقا سلاش ، ولكن لا يتم تجميده.

للتحضير للتشريح ، ضع طبق بتري زجاجي ووجهه لأسفل في صينية مليئة بالثلج. الآن رش أسفل البطن للحيوانات بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام مقص جراحي صغير ، قم بعمل قطع على شكل حرف V عبر الجلد والدهون تحت الجلد في أسفل البطن ، وتمديد الجرح إلى الأطراف البعيدة للتجويف الصدري ، وتعريض الرحم.

باستخدام الملقط ، ارفع الرحم بعناية بين الأجنة. اقطع النسيج الضام بمقص التشريح حتى يتحرر الرحم بالكامل. ثم اشطف الرحم لفترة وجيزة بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة أي دم ، وضعه في أحد أطباق بتري الأربعة المملوءة ب L-15 البارد.

بعد ذلك ، حرر كل جنين من الرحم والكيس الجنيني الداخلي ، باستخدام زوجين من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة. ضع الأجنة المحررة في الطبق الثاني المليء ب L-15 البارد ، ثم انقل الرؤوس إلى طبق بتري الثالث ، والجثث إلى الرابع. في الغطاء الحيوي ، ضع إسفينا من ورق الترشيح المعقم على مرحلة طبق بتري الزجاجي المبرد ، وضع رأس جنين واحد على ورق الترشيح.

بعد ذلك ، ضع حافة القطع للقص السفلي لمقص القزحية في قاعدة الجمجمة ، مع الحفاظ على القص السفلي على السطح الداخلي للجمجمة وبعيدا عن الدماغ ، وقطع الصفيحة القذالية ثم على طول خط الوسط بين الصفائح الجدارية. استمر في القطع بين صفائح الجمجمة الأمامية الغضروفية. ثم ، بدءا من وسط الصفيحة القذالية ، قم بعمل قطع عمودي على يسار ويمين القطع المركزي.

بعد ذلك ، حرك ملعقة صغيرة بحذر بين السطح البطني للدماغ وألواح الجمجمة السفلية ، حتى تصبح تحت الدماغ تماما. ثم ارفع الملعقة لأعلى لإزالة الدماغ. باستخدام ملعقة نظيفة ، قم أولا بإزالة البصلة الشمية ، ثم قم بتشريح الفص الجبهي بنمط شبه منحرف.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر يحتوي على وسط تخزين. في هذا الإجراء ، استخدم شفرات مشرط معقمة لفرم الأنسجة. ثم أضف 2.5 مل من خليط غراء Dnase إلى الأنسجة المفرومة في طبق بتري.

قم بتدوير طبق بتري برفق للتأكد من أن جميع الأنسجة خالية في المحلول ، وعدم الالتصاق بقاع الطبق. بعد ذلك ، ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. في الغطاء الحيوي ، استخدم ماصة نقل معقمة عريضة التجويف لنقل جميع الوسائط والأنسجة إلى أنبوب مبرد معقم سعة خمسة ملليلتر.

ضع طرف ماصة النقل نفسها بالقرب من قاع الأنبوب، وقم بتشويه برفق من 10 إلى 15 مرة. ثم أضف ملليلترين من DMEM 5/5 الدافئ إلى خليط الخلايا المنفصلة ، وقم بتغطية أنبوب الطرد المركزي. امزجها برفق عن طريق الانعكاس ، وقم بطردها بمعدل 573 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في الغطاء الحيوي ، تخلص من كل المادة الطافية دون كسر البليت. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من DMEM 5/5 الدافئ إلى البليت الموجود في الأنبوب لإعادة تعليق الخلايا. استخدم ماصة نقل معقمة صغيرة التجويف لتفتيت البليت عن طريق الأنابيب برفق لأعلى ولأسفل حتى يصبح الخليط متجانسا.

ثم انقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. خارج الغطاء الحيوي ، أضف 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم قم بتحميل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية الزرقاء على شريحة مقياس كثافة الدم للتخلص من أجل حساب الخلايا.

في الغطاء الحيوي ، استخدم ماصة دقيقة معقمة لنقل 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى مركز كل مصفوفة ، وكل طبق بتري للتحكم. ثم ضع أطباق بتري المغطاة في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. بعد ذلك ، أضف برفق ملليلتر واحد من DMEM 5/5 الدافئ إلى كل MEA.

أضف قطرة واحدة من الوسط بعناية في كل مرة حول الحواف الداخلية للمنطقة الشرق الأوسط وإفريقيا ، وتجنب غسل الخلايا بعيدا عن مركز المصفوفة. بعد ذلك ، ضع غطاء يحتوي على غشاء FEP منفذ للغاز على كل MEA قبل إعادته إلى الحاضنة. بعد يومين ، قم بإجراء استبدال متوسط كامل ب DMEM الدافئ + عن طريق سحب الوسيط من الطبق.

ضع طرف الماصة بحذر على الجدار الداخلي ، وقم بتوزيع ملليلتر واحد من DMEM الدافئ + للوجبات اللاحقة ، اسحب 500 ميكرولتر من الوسط من الطبق ، وقم بتوزيع 500 ميكرولتر من DMEM الدافئ + مرة أخرى. في هذا الإجراء ، افحص عينات الطبق كل يومين تحت المجهر ، للبحث عن تغطية الخلايا فوق المصفوفة ، والتلوث إما بالبكتيريا أو الفطريات. قبل إخراج الثقافات من الحاضنة ، قم بتوصيل جهاز التحكم في درجة الحرارة ، وقم بتشغيل النظام ، مما يسمح للوحة القاعدة المسخنة لمكبر الصوت بالوصول إلى 35 درجة مئوية.

ثم ضع الثقافة المغطاة في المضخم الأولي ، بحيث يتماشى الخط الأسود في MEA جيدا مع الأرض المرجعية. تأكد من أن دبابيس المضخم الأولي تصطف بحيث يتم تأمين الجزء العلوي من مكبر الصوت الأولي ، ولا يزال غطاء الثقافة قيد التشغيل. بعد ذلك ، اضغط على ابدأ في بيئة البرنامج لبدء تصور الإشارات.

في النافذة الرئيسية ، حدد Spikes ، Detection ، Automatic ، وقم بتغيير قيمة الانحراف المعياري إلى سالب خمسة ، وانقر فوق Refresh لإعادة تعيين الحد. بعد تصور الإشارات، انقر فوق إيقاف وتسجيل وتشغيل لبدء تسجيل النشاط. يتم طلاء الخلايا العصبية للفأر الجنيني على 60 قناة MEAs ، مما يسمح بالتسجيل المتزامن للنشاط العصبي عبر الشبكة من كل قطب.

فيما يلي مخطط نقطي تمثيلي للنشاط من ثمانية أقطاب كهربائية استجابة للتحفيز قبل التدريب وبعده. يشير الخط الأحمر العمودي إلى وقت التحفيز ، وتشير علامات التجزئة السوداء إلى إمكانات الفعل. في التدريب المسبق ، هناك استجابة فورية لنبض التحفيز عبر القنوات.

في مرحلة ما بعد التدريب ، تظهر الشبكة استجابة نشاط أطول ، بالإضافة إلى الاستجابة الفورية للتحفيز. يظهر هنا متوسط 12 شبكة مدربة و 10 شبكات تحكم ، تشير الشبكات المدربة إلى ترددات ارتفاع متغيرة بشكل كبير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الأنسجة العصبية وربطها من الفئران الجنينية ، وأن تكون قادرا على زراعة وتسجيل وتحفيز الشبكات العصبية من مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة.