نظام متكامل لتشغيل عن بعد توصيل الإشارة داخل الخلايا بوساطة نانوحبيبات Upconversion كيناز فوتواكتيفيشن

الهدف من هذه التجربة هو إثبات إمكانية التنشيط الضوئي للإنزيم باستخدام التشعيع بالأشعة تحت الحمراء القريبة. تم تثبيت بروتين كينيز A المتقيد (Caged-protein kinase A) على سطح جسيمات نانوية صاعدة (upconversion nanoparticles) تم حقنها مجهرياً في الخلايا، وتمت ملاحظة الاستجابة التي حفزها الكينيز في الخلايا الحية بعد التشعيع بالأشعة تحت الحمراء القريبة. يتطلب التنشيط الضوئي التقليدي استخدام الأشعة فوق البنفسجية السامة ضوئياً، والتي ستؤدي حتماً إلى تحفيز تفاعلات كيميائية غير مرغوب فيها واستجابات مماثلة، ومع ذلك، فإن الخيارات الأكثر أماناً، مثل التشعيع بالأشعة تحت الحمراء القريبة، لا يمكنها تحفيز تلك التفاعلات نظراً لطاقتها المنخفضة.

يمكن لجسيمات النانو ذات التحويل التصاعدي تحويل الفوتونات ذات الطاقة المنخفضة في النطاق القريب من الأشعة تحت الحمراء، والصديقة بيولوجياً، بشكل فعال إلى فوتونات عالية الطاقة في النطاق فوق البنفسجي لتحفيز تفاعل كيميائي بالقرب من سطح الجسيم دون الحاجة إلى تشعيع مباشر بالأشعة فوق البنفسجية. وبما أن الكيناز يلعب دوراً رئيسياً في التسرطن، فإن هذه التقنية يمكن أن تساعدنا في فحص المزيد من معلومات نقل الإشارة مع تقليل الضوضاء المتداخلة الناتجة عن السمية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية وتفاعلاتها الجانبية. وبشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذا المجال صعوبات في تعديل الأجهزة والإعدادات البصرية لتطبيقات التحويل التصاعدي.

للبدء، قم بتركيب عدسة شيئية بقوة 4x بجانب حامل الكيوفيت في جهاز الفلوروسبيكترومتر، بحيث يمكن تركيز الليزر في منتصف الكيوفيت. ضع صمام ليزر ثنائي قابل للضبط بطول موجي 980 nanometer بزاوية 90 درجة مقابل العدسة الشيئية. قم بتركيب مرآة عاكسة بالكامل عند نقطة تقاطع مسار الضوء بين العدسة الشيئية والليزر.

لا تنسَ وضع لوح معدني مؤكسد لحجب نافذة الإثارة في جهاز المطياف لحماية الأجزاء الداخلية. ثم ضع كيوفيت تحتوي على محلول جسيمات النانو ذات التحويل التصاعدي والمغلفة بالسيليكا في الحامل. يمكن رؤية شعاع تحويل تصاعدي ساطع عند تشغيل الليزر.

قم بتحويل جهاز المطيافية إلى وضع التألق (luminescence mode)، مع ضبط جهد أنبوب التضاعف الضوئي (PMT) على أدنى قيمة أثناء عمليات المحاذاة. اضبط مراحل المرآة والليزر بحيث يمر الشعاع عبر منتصف الكيوفيت لتمكين أنبوب التضاعف الضوئي (PMT) من التقاط أقوى إشارة. بعد تركيب مرآة ثنائية اللون ومرشح إثارة، قم بتركيب صمام ثنائي ليزري بطول موجي 980 nanometer في مسار الضوء بالطبقة السفلية.

أضف موازياً (collimator) بين الليزر والمرآة للمساعدة في تشتيت وتوسيع منطقة التشعيع بالأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) في المستوى البؤري. ثم استخدم محلول جسيمات نانوية ذات تحويل ترددي صاعد (upconversion nanoparticle) لتصور حزمة الأشعة تحت الحمراء القريبة. اضبط موضع منصة الليزر لتوسيط حزمة ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة لإتمام عملية المحاذاة.

قم بإجراء تخليق caged-PKA ثم قم بتثبيت caged-PKA/UCNP، وذلك لإنتاج caged-PKA/UCNP كما هو موضح في البروتوكول النصي. ولقياس نشاط كلا التركيبين قبل التحلل الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية (UV)، قم بقياس الانخفاض في امتصاص NADH في خليط المقايسة بمرور الوقت بعد إضافة 2 µL من محلول PKA إلى خليط المقايسة. كرر القياس لـ PKA/UCNP.

بعد ذلك، يتم إجراء التحلل الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية بقوة 200 milliwatts per square centimeter لكل من caged-PKA وcaged-PKA/UCNP، في حمام مائي مثلج، للتأكد من إمكانية تنشيط PKA. ويتم تحديد نشاط PKA عن طريق مقايسة إنزيمية مقترنة باستخدام pyruvate kinase lactate dehydrogenase. ومع انخفاض امتصاص NADH، يتم القياس بمرور الوقت بعد إضافة محلول PKA.

قم بتحضين الخلايا في 10% fetal bovine serum يحتوي على وسط L15 خلال فترة الحقن المجهري لضمان التحكم المستقر في pH خارج المحضنة. قم بضبط ساحب الإبر لإنتاج طرف مخروطي الشكل بقطر يبلغ حوالي 1.5 ميكرون لفتح الطرف لاحقاً. ولفتح الطرف، قم بتركيب الإبرة في جهاز الحقن المجهري، وحرك طرف الإبرة ليتلامس مع حافة شريحة، ثم اتبع ذلك باستخدام مقبض تحريك رقيق على منصة المجهر.

تعتبر قوة الاهتزاز هذه كافية لكسر الطرف قليلاً وتوسيع الفتحة. افحص فتحة الإبرة للتأكد من أن قطرها الخارجي يتراوح من 1.3 إلى 1.5 microns، وهو ما يمكن تأكيده عبر صور المجهر باستخدام عدسة شيئية بقوة 40x. بعد ذلك، اضبط ضغط الحقن من 50 إلى 75 hectopascals مع فاصل ضغط يتراوح من 200 إلى 300 milliseconds، واضبط ضغط التعويض الثابت عند 15 إلى 30 hectopascals لمنع تدفق الوسط عكسياً إلى داخل الإبرة.

قم بتحميل معقد caged-PKA/UCNP مع صبغة TAMRA في الموضع الخلفي للإبرة. ثم يتم تثبيت الإبرة المحملة على ميكرومناور هيدروليكي أحادي المحور، بزاوية تتراوح من 30 درجة إلى 45 درجة. افحص الإبرة باستخدام المجهر للتأكد من عدم تكون أي فقاعات بعد تحميل العينة.

بعد غمر الإبرة في الوسط، انتقل إلى وضع الفلورة للتأكد من حدوث تحرر مفاجئ للصبغة عند تطبيق ضغط الحقن، وتحرر بطيء للصبغة عند تطبيق ضغط التعويض بشكل مستمر. ثم انتقل إلى وضع المجال المضيء بتباين الطور لبدء عملية الحقن المجهري للخلايا. ويمكن ملاحظة موجة صدمة الغشاء في عمليات الحقن الناجحة.

اغسل الخلايا مرتين وتحقق من الخلايا المحقونة من وجود فلورية TAMRA المحقونة بالتزامن لتحديد الخلايا التي تم حقنها مجهرياً بنجاح. تشير الخلايا التي تحتوي على UCNP ولكنها تفتقر إلى إشارة الصبغة المحقونة بالتزامن إلى أن غشاء الخلية قد تمزق أثناء الحقن، وبالتالي يجب استبعادها من التجارب اللاحقة. قم بتسليط شعاع من ديود ليزر بطول موجي 980 nanometer على الخلايا في مسار الضوء في الطبقة السفلية، مع التركيز باستخدام عدسة شيئية 10x لمدة 15 minutes.

اترك فترة ظلام لمدة خمس دقائق بعد كل خمس دقائق من التشعيع لتجنب التسخين. إذا كانت هناك حاجة إلى وقت تنشيط أقصر، مثل ثوانٍ أو حتى أجزاء من الثانية، فما عليك سوى الانتقال إلى استخدام عدسة شيئية 40x للحصول على كثافة فوتونية أعلى في بؤرة التركيز. بعد عملية التحلل الضوئي واستعادة الخلايا، قم بتثبيت الخلايا في 1 mL من paraformaldehyde بتركيز 4% في PBS لمدة 20 دقيقة، قبل إجراء صبغة alexa 594 اللاحقة.

أخيراً، قم بتصوير تفكك ألياف الإجهاد الناتج عن الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR). بعد التشعيع بـ NIR، تُظهر الخلايا التي حُقنت مجهرياً بـ caged-PKA/UCNP، كما تشير الأسهم البيضاء، انبعاثاً تحويلياً للأعلى. ويؤدي تفكك ألياف الإجهاد الناتج عن تفعيل PKA الضوئي الناجح بواسطة NIR إلى كشف المزيد من f actin، مما يؤدي بالتالي إلى تلوين أخضر قوي بالقرب من UCNP.

تظهر عينة ضابطة سلبية، حيث يتم الحقن المجهري للخلايا ولكنها تبقى في الظلام، عدم تحلل لألياف الإجهاد. يمكن صبغ مستوى تعرُّض f actin بعد التنشيط الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) باستخدام alexa 594، ثم قياسه كمياً بواسطة image J. تم رسم منحنيات كثافة صبغ f actin على طول السهم الأحمر، مما يوفر معلومات كمية عن تحلل ألياف الإجهاد التي يمكن ربطها بنشاط PKA المستحث بالأشعة تحت الحمراء القريبة. وبمجرد إتقان تقنية الحقن المجهري، يمكن تنفيذ هذه العملية في غضون يوم واحد، بما في ذلك التحضير ومراقبة جودة caged-PKA/UCNP.

من خلال اتباع تعليماتنا الخاصة بتعديلات الجهاز والتجارب، يمكن تحفيز التفاعل المطلوب باستخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة (near IR)، وبدقة مكانية وزمانية عالية تشبه طرق المعايرة التقليدية التي تعتمد على الأشعة فوق البنفسجية (UV)، ولكن دون السمية الضوئية، فهي غير ضارة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، نأمل أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إدخال معقد جسيمات الإنزيم النانوية إلى الخلية عن طريق الحقن المجهري وتنشيط الإنزيم ضوئياً باستخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة المتوافق حيوياً. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الكيميائية الذين يحتاجون إلى استخدام الضوء لتحفيز تفاعل إنزيمي مطلوب في الخلايا الحية لتحقيق دقة مكانية وزمانية عندما لا تتحمل الخلية السمية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن ربط مؤثرات حيوية أخرى بجسيمات النانو ذات التحويل التصاعدي، للإجابة على أسئلة إضافية تتطلب تنشيطاً ضوئياً زمانياً ومكانياً. وإذا كان المؤثر الحيوي يعمل خارج الخلية، فلا داعي حتى لاستخدام الحقن المجهري. كما يمكن لمنصة التنشيط الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة توفير عمق اختراق أكبر في الأنسجة، وبالتالي يمكن تطبيقها في الحيوانات الصغيرة لتحفيز التفاعلات المطلوبة في الوقت والموقع المحددين.