موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات
أغسطس 7, 2017
ويصف هذا البروتوكول تقنية موسع لأخذ عينات السوائل البطانة المخاطية دون عائق من الخطوط الجوية العليا. ويمكن استخدامه لإجراء التقدير الكمي في فيفو مستويات البروتين الوسطاء، مثل السيتوكينات والمستقطبات، في موضوعات في جميع الإعمار.
الهدف العام من طريقة أخذ عينات من سائل البطانة المخاطية هو دراسة البصمة المناعية المحلية لمجرى الهواء دون الحاجة إلى إجراءات التحفيز. تتيح لك هذه الطريقة دراسة الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الجهاز التنفسي لدى الأطفال مثل الالتهابات والربو والحساسية. تتمثل مزايا الطريقة في أنه يمكنك قياس مستويات منخفضة جدا من الوسطاء المناعيين في الغشاء المخاطي لمجرى الهواء غير المحفز في الجسم الحي.
سيتمتوضيح الإجراء من قبل الدكتور وولسك. لجمع عينات حديثي الولادة، قم أولا بقص شريطين على الأقل ثلاثة × 15 ملم من صفائح ترشيح البوليستر الهيدروكسيل الليفية. بعد ذلك ، ضع حديث الولادة على السرير ولاحظ أي أعراض لعدوى مجرى الهواء.
بعد ذلك، استخدم الملقط لإدخال قطعة واحدة من ورق الترشيح حوالي سنتيمترا واحدا في الجزء الأمامي من المحارة السفلية لكل فتحة أنف للرضيع وإعطاء ماء السكر لحديثي الولادة للراحة حسب الحاجة. لاحظ أي عطس أو بكاء مستمر أو رعاف يحدث خلال فترة أخذ العينات. بعد دقيقتين من الامتصاص ، انقل أوراق الترشيح إلى أنبوب مكتوب عليه لتخزينها الفوري عند سالب 80 درجة مئوية.
ستظهر الإجراء التجريبي ليزبيث روزهولم ، فنية في مختبري. لقياس الوسيط المناعي لمجرى الهواء ، ضع ما يصل إلى 10 عينات من سالب 80 درجة مئوية على الجليد وسجل أرقام التعريف الخاصة بها. عندما يتم إذابة العينات، اغمر كل من ورقتي الترشيح لكل موضوع في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت الطازج لكل ورق ترشيح، مع استكمال قرص واحد كامل لمثبط البروتياز لكل 25 مل من محلول المخزون العازلة.
انقل العينات إلى شاكر الألواح بسرعة 400 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. انقل المخزن المؤقت وأوراق الترشيح إلى أكواب مرشحات أنبوب أسيتات السليلوز الفردية. قم بالطرد المركزي للعينات لجمع مستخلص الأنف المصفى في الجزء السفلي من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
ثم قم بإزالة الأكواب وضع الأنابيب على الثلج. بعد ذلك ، قم بنقل 150 ميكرولتر من مستخلص الأنف إلى آبار فردية من ألواح تخزين ملزمة منخفضة البروتين وقم بتخزين الألواح عند سالب 80 درجة مئوية حتى التحليل. بعد ذلك ، قم بقياس تركيز الوسطاء المناعيين الأنفية المعنيين بواسطة مصفوفة متعددة الإرسال تعتمد على التلألؤ الكيميائي الكهربائي عالية الحساسية وفقا لبروتوكولات الفحص القياسية.
في هذا التحليل التمثيلي ل 620 حديث الولادة ، أظهر معظم الوسطاء المناعيين الذين تم قياسهم مستوى منخفضا من الكشف. كانت مستويات جاما IFN أقل من حد الكشف الأدنى في ما يقرب من نصف العينات ، بينما كانت مستويات بيتا TNF alpha و CCL4 و TGF أقل من حد الكشف الأدنى في أقل من 1٪ من العينات. كان من الواضح تعدد الخطيات القوي لمستويات الوسيط المكتشفة البالغ عددها 20 ، كما يتضح من الخريطة الحرارية.
في حديثي الولادة المصابين بفيروس البيكورنا بدون أعراض ، لوحظ وجود ملف تعريف منظم للخطر بشكل رئيسي للوسطاء المناعيين من النوع 1 مما يشير إلى دور مسبب للمناعة لاستعمار البكتيريا والفيروسات في الجزء الأول من الحياة. كما تم تحديد الارتباط بين وجود الأشقاء في الأسرة عند الولادة ، والاستجابة المناعية المخاطية الموجهة من النوع 1 من النوع 17 مع دليل على ارتباط هذه الظاهرة بتأثير فتيلة مناعي في الرحم يرتبط عكسيا بالوقت منذ آخر ولادة. بالإضافة إلى ذلك ، تميز الأطفال المولودون لأمهات يتلقين مكملات عالية مقابل دواء وهمي بزيادة التنظيم في وسطاء مناعي محددين ، مما يشير إلى أن فيتامين دال يعزز استجابة مناعية مضادة للبكتيريا مستقلة عن تلك التي يسببها الفيروس أو البكتيريا أو الأشقاء أو تأتب الأم.
يمكن أيضا استخدام طريقة أخذ العينات المجهرية هذه من خلال منظار القصبات ، مما يسمح بدراسة الوسطاء المناعيين في الشعب الهوائية السفلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الوسطاء في الغشاء المخاطي لمجرى الهواء غير المحفز في الجسم الحي عند الأطفال حديثي الولادة والأطفال الأكبر سنا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تقنية غير باضعة لأخذ عينات من سائل البطانة المخاطية غير المضطرب من المجاري التنفسية العلوية. وتسمح هذه التقنية بتقدير المستويات الحيوية للوسائط البروتينية، مثل السيتوكينات والكيموكينات، لدى الأشخاص من جميع الأعمار.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أمراض الجهاز التنفسي
- علم المناعة
- طب الأطفال
خلفية علمية
- تدرس هذه الطريقة البصمة المناعية المحلية للمجرى التنفسي دون الحاجة إلى إجراءات تحفيز.
- تُطبق هذه الطريقة على أمراض الجهاز التنفسي لدى الأطفال مثل العدوى والربو والحساسية.
- تتيح هذه التقنية قياس المستويات المنخفضة من الوسائط المناعية في مخاطية المجرى التنفسي غير المحفزة داخل الجسم (in vivo).
- يقوم الدكتور Wolsk بتقديم شرح توضيحي لهذا الإجراء.
الغرض من الدراسة
- لبحث الاستجابة المناعية في مخاطية الممرات الهوائية.
- لتقديم رؤى حول أمراض الجهاز التنفسي لدى الأطفال.
- لتيسير تقنيات أخذ العينات غير الغازية لأغراض البحث.
الطرق المستخدمة
- جمع سائل البطانة المخاطية من المجاري التنفسية العلوية.
- استخدام رقائق ترشيح من البوليستر الهيدروكسيلي الليفي لجمع العينات.
- مراقبة أعراض عدوى المجاري التنفسية لدى حديثي الولادة.
- تقدير كمية السيتوكينات والكيموكينات في العينات التي تم جمعها.
النتائج الرئيسية
- الجمع الناجح لسائل البطانة المخاطية دون إجراءات تداخلية.
- القدرة على قياس الوسائط المناعية في الجسم الحي.
- رؤى حول الملف المناعي للمرضى من الأطفال.
- التطبيقات المحتملة في فهم الأمراض التنفسية.
الاستنتاجات
- تُعد طريقة أخذ العينات غير الباضعة فعالة لدراسة مناعة الممرات الهوائية.
- يمكن لهذه التقنية أن تعزز الأبحاث في مجال الصحة التنفسية لدى الأطفال.
- قد تتوسع الدراسات المستقبلية في النتائج المتعلقة بالوسائط المناعية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح طريقة أخذ عينات سائل البطانة المخاطية غير الباضعة هذه التقدير الكمي المباشر للوسطاء المناعيين داخل الجسم في مخاط المجرى التنفسي العلوي دون تحفيز، مما يوفر قراءة ذات صلة فسيولوجياً بالنشاط المناعي للمجاري التنفسية. وتدعم هذه التقنية التوصيف المناعي في المراحل المبكرة من الحياة والمراقبة الطولية، مما يسهل الحد من المخاطر الميكانيكية في تطوير العلاجات التنفسية من خلال ربط التعرضات الجينية والبيئية بالأنماط الظاهرية المناعية. كما يوفر تطبيقها على المجموعات من حديثي الولادة والأطفال قيمة تنبؤية لتحديد الأنماط الداخلية ومراقبة تطور المرض، لاسيما في سياقات الربو والحساسية والأمراض المعدية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس المستويات الأساسية والمستحثة للوسطاء المناعيين في الأنسجة المخاطية غير المحفزة.
- القيمة التشغيلية: توفر مصفوفة قابلة للتكرار وبأقل قدر من التدخل الجراحي للتحقق الوظيفي من الأهداف في المجموعات السكانية من الأطفال.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال ربط ملفات الوسطاء بالأنماط الظاهرية السريرية مثل العدوى الفيروسية بدون أعراض وتأثيرات التعرض للأشقاء.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج عينات بروتينية مستخلصة متوافقة مع مصفوفات التعدد الكيميائي الضوئي ذات الحساسية العالية للتحليل المناعي الكمي.
- التقييس: تستخدم بروتوكولات ثابتة للامتصاص بالورق الترشيحي والاستخلاص لضمان استعادة قابلة للتكرار للمواد التحليلية عبر مختلف الأشخاص والنقاط الزمنية.
- القابلية للتوسع: تم إثبات الجدوى في مجموعات كبيرة من حديثي الولادة (n=620)، مما يدعم تطبيقات الفحص عالي الإنتاجية في الدراسات الوبائية والتدخلية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: تتيح أخذ عينات طولية من الولادة وحتى مرحلة الطفولة، مما يربط البصمات المناعية في بداية الحياة بنتائج الأمراض التنفسية اللاحقة.
- محاذاة المؤشرات الحيوية: تكشف عن زيادة تنظيم الوسائط المناعية من النوع 1 والنوع 17 لدى حديثي الولادة المصابين بالفيروسات البيكورناوية الذين لا تظهر عليهم أعراض، مما يشير إلى الفائدة في تحديد الأنماط المناعية الداخلية.
- الحد من المخاطر الميكانيكية: تكشف عن الارتباطات بين مكملات فيتامين D للأم والاستجابات المناعية المضادة للبكتيريا، مما يدعم تحديد أولويات الأهداف للتدخلات المعدلة للمناعة.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندرج هذه الطريقة ضمن مرحلة بيولوجيا الاكتشاف من خلال تمكين القياس المباشر للوسائط المناعية داخل الجسم (in vivo)، مما يساهم في تحديد الأهداف وتوضيح المسارات قبل مرحلة تحديد المركبات الرائدة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بتنشيط المسارات المناعية في الأنسجة المخاطية دون الحاجة إلى معالجة خارج الجسم أو حدوث شوائب ناتجة عن التحفيز.
- الفحص: تنتج نواتج استخلاص قياسية مناسبة لقراءات المقايسات المناعية المتعددة، مما يسهل التحليل المقارن بين مجموعات العلاج أو التعرض.
- التحليلات: تولد مستويات كمية للوسائط تسمح بالتقييم الإحصائي للتوازي الخطي، ونشاط الشبكة المناعية، والارتباطات المظهرية.
- الأبحاث traslational: تربط الملفات المناعية لحديثي الولادة بأعراض الجهاز التنفسي في مرحلة الطفولة والتعرضات البيئية، مما يدعم قرارات التقدم القائمة على تصنيف المخاطر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تمثل تقنية أخذ عينات متوافقة مع المنصة قابلة للتطبيق عبر نماذج أمراض الجهاز التنفسي والأنماط العلاجية المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف من خلال رصد النشاط المناعي الداخلي في البيئة الدقيقة المخاطية الأصلية.
- القيمة التشغيلية: تضمن قابلية التكرار من خلال إجراءات معيارية للجمع والاستخلاص والتخزين، مما يقلل من التباين في مرحلة ما قبل التحليل.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال ربط الآليات المعدلة للمناعة بالبصمات المناعية في مرحلة مبكرة من الحياة، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من البرامج التنفسية.
- التأثير على محفظة المشاريع: تتيح تحديد أولويات المرشحين بناءً على المخاطر المعدلة وفقاً للتأثيرات المثبتة على المسارات المناعية المخاطية في نماذج بشرية طولية ذات صلة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب تدريباً على تشريح الممرات الهوائية لحديثي الولادة وتقنيات أخذ العينات اللطيفة لضمان راحة الخاضع للفحص وسلامة العينة.
- يعتمد على توفر أنابيب الترشيح الفائق (ultrafilter tubes)، وهزازات الأطباق، والبنية التحتية لمقايسة المخطط المناعي الكيميائي الضوئي (electrochemiluminescence immunoassay) للكشف عن المادة المراد تحليلها.
- يستلزم تحضيراً معيارياً للمحاليل المنظمة (buffer) مع إضافة مثبطات البروتياز لمنع تحلل الوسائط أثناء عملية الاستخلاص.
- يتطلب ملاءمة مدة أخذ العينات أو حجم المرشح عند التطبيق على الأطفال الأكبر سناً أو مواقع مخاطية بديلة.
- يحد منه مدى وفرة المادة المراد تحليلها، حيث تكون بعض الوسائط غالباً دون حد الكشف، مما يستدعي تحسين حساسية المقايسة للأهداف ذات التعبير المنخفض.
